E3泛素蛋白连接酶β-TrCP在常染色体显性多囊肾病中的调控机制及治疗意义

发布时间：2020-06-18 09:50

【摘要】：研究目的:常染色体显性多囊肾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一个系统性疾病,发病率在1/1000~1/400,是最常见的遗传性肾脏病,主要由PKD1或者PKD2基因突变导致。以双侧多发性肾囊肿以及进行性肾脏总体积增大为特征,导致尿液浓缩障碍、高血压、多尿、夜尿症、疼痛、肾结石、血尿,感染和肾功能逐渐丧失。在欧洲,每10名终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)患者中就有1名是ADPKD,在美国、澳大利亚和新西兰每20例终末期肾病患者中有1例有ADPKD。长期以来,多囊肾病的治疗和管理并不像其他肾脏病发展的那么迅速,因此寻找有效治疗ADPKD的方法显得尤为重要。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是重要的蛋白质水解系统,负责降解许多参与细胞生命活动的蛋白质,包括细胞周期进展、凋亡、DNA损伤/修复、内吞作用、耐药性、血管生成和细胞分化,对细胞内环境平衡至关重要,在肿瘤发生和肿瘤存活中发挥着重要作用。β-转导素重复序列包含蛋白(β-transducin repeats-containing proteins,β-TrCP)是SCF家族的一员,在多种肿瘤的发生发展中作用显著。目前很少有关于UPS在常染色体显性多囊肾病中的研究,因此本文主要探讨E3泛素连酶β-TrCP在ADPKD中的作用以及调控机制。并以UPS为靶点,抑制UPS或者特异性抑制β-TrCP观察其对囊肿生长的作用,为临床诊疗ADPKD提供新思路。研究方法:首先我们想了解β-TrCP在多囊肾病中的表达情况,因此我们通过蛋白免疫印迹(Western blot)、免疫组化、免疫荧光等多种方法检测了多囊肾病患者肾组织、PKD小鼠模型肾组织以及人永生化的囊肿衬里上皮细胞(Pkd1~(+/-)细胞)中的β-TrCP,发现其表达上调。其次,我们想要了解β-TrCP在多囊肾病中表达上调的机制。我们在囊肿衬里上皮细胞中过表达以及抑制STAT1检测β-TrCP的表达以及启动子活性,随之我们过表达PC1 C末端剪切片段(Polycystin1 C terminal tail,PC1-CTT)检测β-TrCP的表达以及启动子活性,验证PC1-CTT是否可以通过激活JAK2-STAT1通路上调β-TrCP的表达。紧接着我们想要了解β-TrCP过表达在多囊肾病发展中的作用。我们通过给予MDCK细胞UPS抑制剂PS-341处理以及在IMCD3细胞中特异性敲低β-TrCP,发现囊泡生长受到抑制,证实了β-TrCP在多囊肾病中作为癌蛋白的身份。接下来,我们检测了PS-341处理以及特异性敲低β-TrCP后细胞的增殖和凋亡情况、纤毛的形态和纤毛上多囊蛋白2(Polycustin 2,PC2)的表达,以及β-TrCP的底物PDCD4以及PC2总量变化,并进一步探讨了自噬降解途径与泛素-蛋白酶体途径的交叉和相互作用。由于目前还没有特异性的β-TrCP抑制剂,因此我们暂且选择蛋白酶体抑制剂PS-341作为治疗性药物,在早发型PKD小鼠模型中探讨其对多囊肾病的治疗作用。给予PKD小鼠模型PS-341 0.3mg/kg腹腔注射,每周两次。收集标本检测肾功能和囊肿指数以及生存曲线。结果:我们发现E3泛素蛋白连接酶β-TrCP在常染色体显性多囊肾病患者、PKD小鼠模型以及囊肿衬里上皮细胞中表达上调,且主要定位细胞核中。接着我们研究了β-TrCP在囊肿衬里上皮细胞中高表达的机制,发现囊肿形成后,PC1-CTT剪切增多,PC1-CTT通过活化下游JAK2-STAT1信号通路促进β-TrCP表达。接下来我们研究β-TrCP的作用,我们发现PS-341可以通过增加纤毛长度以及纤毛上PC2的表达,促进细胞凋亡、抑制细胞增殖,最终抑制三维立体培养环境下MDCK细胞形成囊泡,但对β-TrCP的底物PDCD4和PC2的总量没有影响。特异性下调β-TrCP可以抑制IMCD3细胞形成囊泡,在人的囊肿衬里上皮细胞中特异性敲低β-TrCP后,纤毛变长,纤毛上PC2表达增加,PDCD4表达上调,PC2总量变化不明显,说明下调β-TrCP可以通过上调其底物PDCD4以及促进纤毛的形成和PC2在纤毛上的定位抑制囊泡生长。而过表达BTRC基因后,纤毛变短,甚至不能正常形成。但是,PS-341处理细胞后,PDCD4和PC2的泛素化降解受到抑制,为什么其总蛋白量却没有改变呢?这使得我们继续探讨其原因,我们发现,PS-341处理囊肿细胞后,自噬通路代偿性活化。PDCD4和PC2可能通过自噬通路代偿性降解。动物实验结果发现,PS-341治疗后,小鼠肾脏的囊肿指数显著降低,肾功能明显改善,生存时间明显延长。我们进一步检测了肾组织中增殖、凋亡和炎症指标,发现PS-341治疗后小鼠肾组织增殖减弱,凋亡增加,炎细胞浸润明显减少。结论:(1)在常染色体显性多囊肾病中,PC1-CTT通过活化JAK2-STAT1通路促进β-TrCP的表达;(2)β-TrCP作为癌蛋白在ADPKD中高表达;(3)特异性抑制β-TrCP可以通过上调PDCD4、增加纤毛长度以及PC2在纤毛上的有效剂量抑制囊泡生长;(4)PS-341促进细胞凋亡、抑制细胞增殖,最终抑制囊泡生长,可能是通过使纤毛变长,增加纤毛上的PC2的表达实现的。(5)PS-341可以通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡以及减少肾间质巨噬细胞浸润,显著地抑制囊肿生长、改善肾功能,并且显著延长多囊肾病小鼠的生存时间。(6)广谱抑制UPS治疗ADPKD引起自噬通路代偿性活化,可能会伴随某些副作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

示意图,示意图,血液系统肿瘤,抗肿瘤治疗

TrCP 在常染色体显性多囊肾病中的调控机制及治疗意义- 9 -图1 泛素-蛋白酶体系统示意图[36]E3泛素连接酶β-TrCP是SCF家族的一员，鉴于其底物的多样性，β-TrCP可能同时发挥致癌作用和抑癌活性。但可以确定的是，在特定的组织里，一些抑癌因子作为其底物，例如IκB（NF-κB 的负性调控因子）[37]， PDCD4（Eif4A介导的蛋白转录的负性调控因子）[38]，以及BimEL（一个强效的促凋亡蛋白）[39]，因此β-TrCP是致癌基因。以蛋白酶体作为抗肿瘤治疗的靶点，20S蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ,Bortizomib）已经被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤以及其他的一些血液系统肿瘤

肾组织,多囊肾病,患者

E3 泛素蛋白连接酶 β-TrCP 在常染色体显性多囊肾病中的调控机制及治疗意义实验结果（一） -TrCP 在多囊肾病患者肾组织中的表达我们取手术切除的晚期 ADPKD 患者的肾组织为多囊肾病标本，肾癌患者手术除距癌组织 5 厘米以上的肾组织为正常对照标本，使用蛋白免疫印迹法（Westernlotting）检测 β-TrCP 的表达水平，并进行灰度分析，结果发现，与对照组（1.0000.08948 ）相比， -TrCP 在 ADPKD 患者（3.154 ±0.2932 ）肾组织中表达明显升，P=0.0022，见图 1-1-1、图 1-1-2。

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