UBAC2调控P27转录对膀胱癌细胞增殖的影响及机制研究

发布时间：2020-06-21 15:49

【摘要】：研究背景和目的膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿外科临床上常见的恶性肿瘤之一,也是一个在全球范围内危害人类健康的棘手问题。虽然随着医疗水平及肿瘤诊治能力的提升,膀胱癌的治疗也出现新思路,但是目前膀胱癌的治疗仍是以外科手术切除为主,同时辅以放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗及介入治疗等的综合治疗。在我国,膀胱癌的发病率虽远不及西方发达国家,但其发病率及死亡率在近几十年来同样呈上升趋势。因此,对膀胱癌发生、进展、侵袭转移、复发及耐药等相关机制的研究已经成为当前的热点和重点,以期探寻新靶点为其诊治提供理论依据。泛素相关结构域样蛋白2(ubiquitin-associated domain-containing protein 2,UBAC2)是一种存在于多物种的高度保守的蛋白质,其表达水平在不同类型及病理级别的膀胱癌中存在差异,但UBAC2在膀胱癌中的作用及机制仍有待明确。因此,本研究旨在探究UBAC2在人膀胱癌组织中的表达情况并分析其与临床病理相关指标的关系,最后初步探索其在膀胱癌中作用及机制。研究对象和方法1.收集我院46例因膀胱癌而行根治性膀胱切除术后的新鲜手术标本及患者相应临床病理资料,取手术切除下来的膀胱癌组织及其对应正常膀胱黏膜组织,采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测并分析组织标本中UBAC2基因mRNA的表达水平,同时分析UBAC2表达水平和膀胱癌患者临床病理特征间的关系。2.同时采用免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)检测UBAC2蛋白在膀胱癌组织及其对应癌旁正常膀胱组织中的表达水平,并分析其差异。3.采用qRT-PCR和western blot法分别检测并分析人永生化膀胱尿路上皮细胞系SV-HUC-1和膀胱癌细胞系EJ及UMUC3中UBAC2基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。4.根据蛋白数据库网站The Human Protein Atlas利用癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中膀胱癌患者相关临床随访数据及UBAC2表达水平制作Kaplan-Meier生存曲线,分析膀胱癌患者肿瘤组织中UBAC2表达水平和患者预后之间的关系。5.构建短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导UBAC2沉默的质粒载体,并转染入EJ和UMUC3细胞,转染48h后,更换新鲜完全培养基,加入嘌呤霉素,逐渐加量进行细胞筛选。6.结合荧光倒置显微镜观察筛选细胞荧光情况,分别提取沉默对照组(shNC)和UBAC2沉默组(shUBAC2)稳转细胞总RNA和蛋白,利用qRTPCR及western blot法检测UBAC2 mRNA及蛋白沉默效率。7.利用稳转细胞,应用CCK-8试剂盒及平板克隆形成实验检测UBAC2沉默组及对照组细胞增殖能力的变化。8.采用qRT-PCR及western blot检测UBAC2沉默组(shUBAC2)及对照组(shNC)细胞中与增殖相关蛋白表达水平的变化,明确UBAC2与p27间的可能调控关系。结果1.与正常膀胱组织(1.220±0.797)相比,UBAC2基因mRNA在膀胱癌组织(3.802±2.931)中表达明显上调(P0.001)。免疫组织化学染色法检测结果发现,相对于其对应癌旁正常膀胱组织,UBAC2蛋白在大部分(31/46)膀胱癌组织中表达升高。对于膀胱癌细胞系,qRT-PCR结果显示:与SV-HUC-1(1.000±0.029)细胞相比,膀胱癌细胞系EJ(2.273±0.040)和UMUC3(3.037±0.115)中UBAC2 mRNA水平均明显上调(P0.001)。Western blot结果也显示:EJ细胞和UMUC3细胞中UBAC2蛋白相对于SV-HUC-1细胞表达升高(P0.001)。2.临床病理特征分析表明,UBAC2表达水平与膀胱癌病理分级明显相关(P=0.023),而与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小等均无明显相关(P0.05)。3.生存分析发现,膀胱癌组织中UBAC2表达的高低与膀胱癌患者的生存时间显著相关(P=0.035)。膀胱癌中UBAC2表达水平越高,膀胱癌患者的生存时间越短;相反,UBAC2表达水平越低,患者的生存时间越长。4.转染shRNAs并经筛选后,qRT-PCR及western blot检测显示shUBAC2组细胞UBAC2 mRNA及蛋白的表达水平较shNC组明显降低(P0.05),其中以shUBAC2-1及shUBAC2-3沉默效率较高,用于后续实验。5.CCK-8实验显示:EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组较shNC组在相对应时间点450nm波长下的吸光度明显降低(P0.05);平板克隆形成实验显示EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组克隆形成数明显少于shNC组(P0.001)。6.western blot结果显示:EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组细胞p27蛋白表达水平较shNC组都明显升高(P0.05),而其他与增殖相关蛋白:p21,CyclinD1,CyclinE,CDK2,CDK4,CDK6无明显差异(P0.05)。qRT-PCR发现,EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组细胞p27 mRNA表达水平均较shNC组明显升高(P0.05)。结论1.UBAC2在膀胱癌组织及细胞系中的表达水平明显上调,并且可以作为一个预测膀胱癌患者的预后指标。2.沉默UBAC2能够抑制膀胱癌细胞的增殖。3.UBAC2可能在转录水平上调控p27。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14
【图文】：

C2 在膀胱癌组织和细胞系中的表达明显上调 UBAC2 基因在膀胱癌组织中表达水平，我们同时采用了方法分别在 mRNA 和蛋白水平检测 46 对膀胱癌及其对应的 UBAC2 基因的表达。qRT-PCR 结果显示：与正常膀胱组相比，UBAC2 基因 mRNA 水平在膀胱癌组织（3.802±2.93.05）（图 3.1.1）。免疫组织化学染色法检测结果发现，相对于AC2 蛋白在大部分（31/46）膀胱癌组织中表达升高（以图

±0.797）相比，UBAC2 基因 mRNA 水平在膀胱癌组织（3.802±2.931）中明显上调（P<0.05）（图 3.1.1）。免疫组织化学染色法检测结果发现，相对于正常膀胱组织，UBAC2 蛋白在大部分（31/46）膀胱癌组织中表达升高（以图 3.1.2 为典型）。图 3.1.1 qRT-PCR 检测 UBAC2 基因 mRNA 在 46 对膀胱癌及其对应正常癌旁组织中癌组织表达水平上调

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本文编号：2724282