MicroRNA-1470、MicroRNA-4483在慢性肾脏纤维化中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-26 03:07

【摘要】：慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD),定义为各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍(肾脏损害病史大于3个月),包括肾脏GFR正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常,及影像学检查异常,或不明原因GFR下降(60ml/min·1.73m~2)超过3个月。现如今,CKD正日益成为一个重要的公共卫生问题,我国CKD的患病率约为10.8%~([1])。肾脏纤维化是CKD的共同病理特征,主要表现在细胞外基质的大量堆积和肾小管萎缩,是导致终末期肾病(ESRD)的共同过程~([2])。抗纤维化药物可减缓甚至阻止CKD的进展。近来新的证据表明,针对肾脏纤维化相关基因的miRNAs可能是CKD抗纤维化治疗的潜在新靶点。MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性非编码小分子RNA,主要通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合,阻止mRNA转录本被翻译成蛋白质来控制基因表达,作为器官发生、癌症和疾病的关键调控因子越来越受到人们的关注~([3])。研究表明,microRNAs在各种肾脏疾病的发病机制中起重要作用。而肾脏纤维化是各种慢性肾脏病进展至终末期的共同途径。近年研究表明,在肾脏组织中存在的一些miRNAs对肾脏纤维化的发生与发展有着重要的作用,深入地了解它们之间的关系可以为临床肾脏纤维化的治疗提供新的治疗靶点。实验一:筛选并验证FSGS、DN、MCD患者肾组织与正常肾组织之间差异表达的microRNAs目的:筛选符合条件的FSGS、DN、MCD患者,筛选并验证FSGS、DN、MCD患者肾组织与正常肾组织中差异表达的microRNAs。方法:利用高通量microRNAs芯片技术筛选FSGS、DN、MCD患者肾组织与正常肾组织对比差异表达的microRNAs,并采用Real-time PCR、原位杂交方法验证部分差异microRNAs的表达和定位。结果:(1)根据中山大学附属第一医院肾内科肾穿病理结果,筛选符合条件的FSGS、DN、MCD患者肾组织,高通量microRNAs芯片结果提示与正常肾组织相比,FSGS、DN、MCD患者肾组织中689个差异表达的microRNAs(FC-CUT=1.5;P-value=0.05为筛选标准),上调表达的有262个microRNAs,下调表达的有427个microRNAs,其中microRNA-1470是上调表达倍数最明显的microRNA,而microRNA-4483是下调表达最显著的microRNA。(2)原位杂交结果示miR-1470、miR-4483位于人肾小管上皮细胞的胞浆中。(3)与同周龄db/m小鼠相比,从8w开始db/db糖尿病小鼠体重及血糖水平明显升高,16w db/db小鼠的血肌酐水平与24h尿蛋白定量均明显增高,HE、Masson、PASM、PAS染色示16w、24w db/db小鼠糖尿病小鼠,肾小球肥大,体积增大,肾小球系膜基质明显扩增,且肾小球和肾间质胶原沉积更明显,以上结果表明db/db糖尿病小鼠于16w时已经出现糖尿病肾病的表现,且与24w时糖尿病肾病表现更明显。与control小鼠相比,FSGS小鼠于8w后血肌酐水平与24h尿蛋白定量均较control小鼠明显增高,HE、Masson、PASM、PAS染色示肾小球硬化,肾间质胶原沉积明显等表现。(4)与db/m及control小鼠肾组织相比,miR-1470在db/db糖尿病小鼠、FSGS肾组织中明显增高;miR-4483在db/db糖尿病小鼠、FSGS肾脏组织中表达明显降低。同样在DN、FSGS患者肾组织中,QPCR可见miR-1470上调,而miR-4483明显下调。在体外HK-2细胞中,与TGF-β1(-)及正常糖浓度培养(12.5mmol/L)相比,miR-1470在TGF-β1(+)(10ng/ml)及高糖刺激(30mmol/L)的HK-2细胞中表达明显增高,而miR-4483的表达明显下调。小结:高通量microRNAs芯片检测结果示与正常肾脏比较,FSGS、DN、MCD患者肾组织有689个差异表达的microRNAs,其中miR-1470上调表达倍数最明显的microRNA,而miR-4483是下调表达最显著的microRNA。原位杂交示miR-1470、miR-4483位于人肾小管上皮细胞的胞浆中。miR-1470、miR-4483在DN、FSGS患者、小鼠模型的肾脏组织及TGF-β1、高糖刺激的人肾小管上皮细胞(HK-2)中的表达与芯片一致。实验二:miR-1470、miR-4483在DN、FSGS肾组织纤维化中的作用目的:探讨mi R-1470、mi R-4483在DN、FSGS肾组织纤维化中的作用。方法:通过在人肾小管上皮细胞(HK-2)中干扰及过表达mi R-1470、mi R-4483,采用QRT-PCR检测HK-2细胞中a-SMA、collagen I、collagen III、Fibronectinm RNA表达变化,Western blot、Immunofluorescence方法检测细胞中纤维化蛋白表达水平的变化。结果:(1)与转染mimic negative control的HK-2细胞相比,转染了mi R-1470、mi R-4483 mimic过表达质粒的HK-2细胞中mi R-1470、mi R-4483表达上调,体外过表达mi R-1470可使HK-2细胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表达明显增高,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纤维蛋白表达增高;而体外过表达mi R-4483可使HK-2细胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表达明显降低,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纤维蛋白表达减少。(2)与转染inhibitor negative control的HK-2细胞相比,转染了mi R-1470、mi R-4483 inhibitor干扰质粒的HK-2细胞中mi R-1470、mi R-4483表达下调,体外抑制mi R-1470可使HK-2细胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表达明显降低,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纤维蛋白表达减轻;而体外抑制mi R-4483可使HK-2细胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表达明显增强,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纤维蛋白表达增高。小结:在TGF-β1、HG刺激下的HK-2细胞中,mi R-1470促进HK-2细胞纤维化蛋白的合成,是损害性因子,而mi R-4483抑制其纤维化蛋白的合成,是保护性因子。实验三:mi R-1470、mi R-4483在肾脏纤维化中作用的机制研究目的:研究mi R-1470、mi R-4483在体外HG、TGF-β1刺激下影响肾脏纤维化的相关作用机制。方法:采用生物信息学方法预测与mi R-1470、mi R-4483结合的与肾脏纤维化相关的下游靶基因,采用QRT-PCR方法检测在HEK293T细胞中干扰或过表达mi R-1470、mi R-4483后相应靶基因的表达情况,采用双荧光素酶报告基因方法验证mi R-1470、mi R-4483与其下游靶基因是否结合,并通过突变结合部位建立突变型质粒,从而确定mi RNA与下游靶基因的结合位点。结果:(1)生物信息学网站预测,符合筛选条件的下游靶基因:mi R-1470有42个与肾脏纤维化相关的下游靶基因,而mi R-4483有26个与肾脏纤维化相关的下游靶基因。(2)通过QPCR验证,在293T细胞中上调mi R-1470表达后,MMP14、MMP2、MMP13、MMP9、CTGF表达降低,而下调mi R-1470后,MMP14、MMP2、MMP13、MMP9、CTGF表达增高。而293T细胞中上调mi R-4483表达后,TIMP1表达降低,下调mi R-4483后,TIMP1表达增高。(3)双荧光素酶基因报告系统结果示与MMP13野生型载体共转染时,与对照mimic control、negative control相比,转染mi R-1470 mimic可使293T细胞的荧光素酶活性降低;与TIMP1野生型载体共转染时,与mimic control、negative control相比,转染mi R-4483 mimic可使293T细胞的荧光素酶活性降低。而mi R-1470 mimic与MMP13突变型质粒、mi R-4483 mimic与TIMP1突变型质粒共转染时,对293T细胞荧光素酶活性的恢复作用不太明显,下一步继续构建突变型质粒进行双荧光素酶分析。小结:通过生物信息学预测,QPCR与双荧光素酶基因报告验证MMP13可能是mi R-1470的下游靶基因,TIMP1可能是Mi RNA-4483的下游靶基因之一。结论:1.本研究通过高通量micro RNAs芯片检测结果示与正常肾脏比较,FSGS、DN、MCD患者肾组织有689个差异表达的micro RNAs,其中mi R-1470上调表达倍数最明显的micro RNA,而mi R-4483是下调表达最显著的micro RNA。原位杂交示mi R-1470、mi R-4483位于人肾小管上皮细胞的胞浆中。mi R-1470、mi R-4483在DN、FSGS患者、小鼠模型的肾脏组织及TGF-β1、高糖刺激的人肾小管上皮细胞(HK-2)中的表达与芯片一致。2.在TGF-β1、HG刺激下的HK-2细胞中,mi R-1470促进HK-2细胞纤维化蛋白的合成,是损害性因子,而mi R-4483抑制其纤维化蛋白的合成,是保护性因子。3.mi R-1470可能与下游靶基因MMP13结合,从而抑制其表达,促进肾脏纤维化进程;而mi R-4483可能与下游靶基因TIMP1结合,抑制TIMP1表达,从而抑制肾脏纤维化进程。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

差异表达

男 49 878361 14174 2011-3-31男 56 883511 14286 2011-5-12表 4 各组中差异表达的 miRNAsMCD FSGS DNup 80 71 111down 122 150 155Only FSGS&DNcommom-up14Only FSGS&DNcommom-down21all-up 40all-down 76:1.5 ; P-value-CUT:0.05）

检测结果,机制研究,兰州大学,硕士学位论文

兰州大学硕士学位论文 MicroRNA-1470、MicroRNA-4483 在慢性肾脏纤维化中的作用及机制研究1.3.2 microRNAs 表达谱芯片结果以（FSGS/control,DN/control，MCD/control）>=1.5，P-value=<0.05 作为筛选标准，共筛选出 682 个差异表达的 microiRNAs（图 1-2）。A BC

【相似文献】