HIF-1α信号通路在慢性肾脏病血管钙化中的表达及作用研究

发布时间：2020-07-18 04:16

【摘要】：目的:血管钙化(vascular calcification,VC)是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的常见并发症,在CKD各个阶段均可发生,严重影响CKD患者的生命健康,然而其发生发展的具体机制仍未完全阐明,临床防治措施有限。因此本研究通过腺嘌呤灌胃联合高磷饲料喂养诱导CKD血管钙化大鼠模型,观察大鼠主动脉低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factors 1alpha,HIF-1α)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)及Notch1的表达,探讨HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路在CKD血管钙化中的作用,为探索CKD血管钙化的具体机制及临床防治措施提供新策略。方法:将60只SD大鼠随机分为对照组(CON组,15只)、腺嘌呤灌胃组(CKD组,20只)、腺嘌呤灌胃联合高磷饲料喂养组(CKD+HP组,25只)。CON组及CKD组予以普通大鼠饲料喂养,CKD+HP组予以1.2%高磷饲料喂养;CKD组及CKD+HP组将2.5%腺嘌呤混悬液以250mg/(kg·d)的剂量第1-4周每日灌胃1次,第5-8周隔日灌胃1次,CON组予以10ml/kg生理盐水灌胃。在建模后第4、6与8周末,分别从各个组中随机选取5只大鼠收集标本:收集24h尿液检测尿蛋白定量;腹主动脉采血检测尿素(Urea)、肌酐(Scr)、胱抑素(Cys C)、血钙(Ca~(2+))和血磷(P~(3-));酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清HIF-1α水平;测量肾重/体重指数;苏木精-伊红(HE)染色法观察肾脏及血管病理改变;全组织Von kossa染色、茜素红染色与主动脉钙含量测定评估血管钙化情况;免疫组化检测大鼠主动脉α-SMA、Runx2、HIF-1α、VEGFA及Notch1蛋白表达;Real-time PCR检测大鼠主动脉组织α-SMA、Runx2、HIF-1α、VEGFA和Notch1 mRNA表达。结果:1、大鼠体重、肾重及肾重/体重指数:与CON组相比,CKD及CKD+HP组大鼠体重各时间点均明显降低(P0.001),肾重及肾重/体重指数均明显升高(P0.001);与CKD组相比,CKD+HP组大鼠体重在第4周和第8周末更低(P0.01;P0.05),肾重在第6周末更高(P0.001),肾重/体重指数在第4周与第6周末更高(P0.05;P0.001)。2、血清学指标:(1)Urea、Scr与Cys C:与CON组相比,CKD及CKD+HP组大鼠各时间点Urea、Scr与Cys C明显增加(P0.01);与CKD组相比,CKD+HP组大鼠各时间点Scr更高(P0.05),各时间点Urea及Cys C无明显差异。(2)Ca~(2+)、P~(3-)与Ca~(2+)×P~(3-):与CON组相比,CKD+HP组大鼠第4周及第8周血Ca~(2+)降低(P0.05),CKD组及CKD+HP组大鼠各时间点血P~(3-)及Ca~(2+)×P~(3-)明显升高(P0.01;P0.05);与CKD组相比,CKD+HP组大鼠第6周和第8周末血P~(3-)及Ca~(2+)×P~(3-)更高(P0.01,P0.05)。3、24h尿蛋白定量:CKD及CKD+HP组大鼠各时间点24h尿蛋白定量较CON组明显增加(P0.01),而CKD组与CKD+HP组无明显差异;CKD及CKD+HP组24h尿蛋白定量随时间进展逐渐增多(P=0.009,P=0.003)。4、血清HIF-1α水平:CKD及CKD+HP组血清HIF-1α水平随时间进展逐渐增多(P=0.009,P=0.033),在第8周末其水平较CON组明显升高(P0.05),而两组在各个时间点无明显差异。5、肾脏病理改变:(1)肉眼:CON组:双侧肾脏大小正常,色暗红,表面光滑,质软,弹性好,切面皮髓质分界清晰;CKD与CKD+HP组:双侧肾脏体积增大,色灰白,呈“大白肾”改变,表面不光滑,质硬,弹性差。(2)HE染色:CON组肾小球、肾小管及肾间质结构及形态均正常;CKD及CKD+HP组自第4周末部分肾小球可见萎缩、囊腔轻度扩张,肾小管扩张、较多棕黄色物质沉积,肾间质纤维化,后随时间进展病变逐渐加重,且CKD+HP组肾间质纤维化较CKD组出现早、程度重。6、主动脉病理改变:(1)肉眼:CON组各时间点大鼠主动脉形态正常,弹性好;CKD组第4周末大鼠形态尚光滑,弹性稍差,自第6周末大鼠主动脉逐渐出现弯曲、膨大,钙化结节,弹性差,血管脆性增加;CKD+HP组第4周末大鼠主动脉即弯曲、膨大明显,表面不光滑,出现钙化结节,弹性极差,易脆,且随时间进展钙化结节逐渐增多。(2)HE染色:CON组各时间点大鼠主动脉形态结构正常;CKD组第4周末大鼠主动脉中膜弹性纤维排列紊乱,第6周末主动脉中膜呈节段性断裂,弹性纤维减少,第8周末中膜呈连续线性断裂,弹性纤维更少;CKD+HP组自第4周末大鼠主动脉即可见管壁增粗,中膜呈连续线性断裂,弹性纤维明显减少,并随时间进展逐渐加重。7、主动脉钙化情况:(1)全段血管Von kossa染色:CON组大鼠主动脉无黑色物质沉积;CKD组大鼠主动脉第6周末可见节段性黑色物质沉积,第8周末黑色物质沉积明显增加;CKD+HP组第6周及第8周大鼠主动脉全段血管均可见黑色物质弥漫性沉积。(2)茜素红染色:CON组各时间点大鼠主动脉未见橘红色物质沉积;CKD组大鼠主动脉自第6周末可见节段性橘红色物质沉积,第8周末橘红色物质沉积明显增加;CKD+HP组大鼠主动脉自第4周末可见橘红色物质呈连续线状沉积于主动脉中膜,并随时间进展,橘红色物质沉积逐渐增多。(3)大鼠主动脉钙含量:CKD+HP组各时间点主动脉钙含量均较CON及CKD组明显增加(P0.001,P0.05),CKD组第6周与第8周主动脉钙含量较CON组明显增加(P0.001),且CKD+HP及CKD组主动脉钙含量随时间进展逐渐增加(P=0.002,P0.001)。8、主动脉蛋白表达:(1)α-SMA蛋白表达:与CON组相比,CKD组大鼠在第6周与第8周末及CKD+HP组大鼠各时间点主动脉α-SMA蛋白表达明显降低(P0.01),且CKD组α-SMA的表达随时间进展逐渐降低(P=0.001);与CKD组相比,CKD+HP组大鼠在第4周及第6周主动脉α-SMA蛋白表达更低(P0.05)。(2)Runx2蛋白表达:CKD+HP组大鼠各时间点主动脉Runx2蛋白表达较CON及CKD组均明显升高(P0.001,P0.01),CKD组大鼠在第6周和第8周末主动脉Runx2蛋白表达较CON组明显升高(P0.01),且CKD及CKD+HP组Runx2蛋白表达随时间进展逐渐增加(P0.001,P=0.017)。(3)HIF-1α蛋白表达:CKD+HP组大鼠各时间点主动脉HIF-1α蛋白表达较CON及CKD组均明显升高(P0.001,P0.05);CKD组大鼠在第6周与第8周末主动脉HIF-1α蛋白表达较CON组明显升高(P0.01),且CKD组HIF-1α的表达随着时间进展逐渐增加(P0.001)。(4)VEGFA蛋白表达:与CON组相比,CKD组大鼠第6周与8周时、CKD+HP组大鼠各时间点主动脉VEGFA蛋白表达均明显增加(P0.05,P0.001);与CKD组相比,CKD+HP组大鼠第4周与8周末主动脉VEGFA蛋白表达更高(P0.05);CKD及CKD+HP组VEGFA的表达均随时间进展逐渐增加(P=0.001,P=0.007)。(5)Notch1蛋白表达:与CON组相比,CKD组大鼠在第8周末、CKD+HP组大鼠各时间点主动脉Notch1蛋白表达明显增加(P0.01,P0.001),且CKD组Notch1的表达随时间进展而增加(P=0.001);与CKD组相比,CKD+HP组大鼠在第4周与6周末主动脉Notch1蛋白表达更高(P0.05)。9、主动脉mRNA表达:(1)α-SMA与Runx2 mRNA的表达:与CON组相比,CKD组大鼠在第8周末、CKD+HP组大鼠各时间点主动脉α-SMA mRNA表达明显减低(P0.01,P0.05),与CKD组相比,CKD+HP组大鼠主动脉α-SMA mRNA表达在第4周末更低(P0.05),且CKD组α-SMA mRNA的表达随时间进展逐渐降低(P=0.014);CKD+HP组大鼠主动脉各个时间点Runx2 mRNA表达较CON组及CKD组均明显升高(P0.05),CKD组大鼠在第6周与第8周主动脉Runx2mRNA表达较CON组明显升高(P0.05)。(2)HIF-1α、VEGFA与Notch1mRNA表达:与CON组相比,CKD组大鼠主动脉第8周末HIF-1α和Notch1 mRNA表达以及第6周与第8周末VEGFA mRNA的表达明显增加(P0.05),CKD+HP组大鼠各时间点主动脉HIF-1α、VEGFA与Notch1mRNA表达明显增加(P0.01,P0.05,P0.05),与CKD组相比,CKD+HP组大鼠主动脉HIF-1αmRNA表达在第4周及第6周末更高(P0.05),VEGFA mRNA表达在第4周及第8周末更高(P0.05,P0.01),Notch1表达在第4周末更高(P0.05),且CKD组HIF-1α和Notch1mRNA及CKD+HP组VEGFA mRNA的表达随时间进展逐渐增(P=0.007,P=0.001,P0.001)。10、相关性分析:大鼠主动脉钙含量与血清P~(3-)(r=0.618,P0.001)、Ca~(2+)×P~(3-)(r=0.590,P0.001)、血清HIF-1α(r=0.706,P0.001)、主动脉HIF-1α(r=0.852,P0.001)、VEGFA(r=0.747,P0.001)与Notch1(r=0.813,P0.001)蛋白表达呈正相关,与血清钙无显著相关性(r=-0.246,P=0.104);血清磷与血Urea、Scr、Cys C及24h-UPro明显相关(r=0.559,P0.001;r=0.676,P0.001;r=0.537,P0.001;r=0.539,P0.001);主动脉VEGFA蛋白表达与主动脉HIF-1α(r=0.738,P0.001)蛋白表达明显相关;主动脉Notch1蛋白表达与主动脉HIF-1α和VEGFA蛋白表达明显相关(r=0.865,P0.001;r=0.699,P0.001)。结论:1、腺嘌呤灌胃联合高磷饲料喂养大鼠,较单独腺嘌呤灌胃能够更加快速、稳定地建立慢性肾脏病血管钙化动物模型;2、高磷血症促进慢性肾脏病血管钙化及肾脏病进展;3、慢性肾脏病大鼠主动脉钙化时存在HIF-1α-VEGFANotch1信号通路激活,表明HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路可能参与了CKD血管钙化的发生发展;4、慢性肾脏病血管钙化大鼠血清HIF-1α水平明显升高,且与主动脉钙化严重程度成显著正相关,有望成为评估CKD血管钙化严重程度的血清学标志物之一。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

大鼠,毛发,精神状态,饮水量

大小便正常，体重逐渐增加。CKD 组：灌胃后第 3 周起，大鼠精神状态欠佳，摄食量减少，饮水量增加，反应稍迟钝，活动度减少，毛发黯淡、竖毛，大便正常，小便增多，体重减轻。第 4 至 5 周时大鼠精神状态差，摄食量明显减少，阴毛湿润，并出现死亡。第 6 周后进食稍增加，体重基本稳定，未再出现死亡。CKD+HP 组：灌胃后第 2 周起，大鼠精神状态不佳，摄食量减少，饮水量增加，反应稍迟钝，活动度减少，毛发黯黄散乱（如图 1.1），体重减轻，外阴毛发湿润，尾巴湿冷，大便正常，小便增多。第 3 周起摄食量及体重明显减少，并开始出现死亡。第 4 至 5 周时大鼠精神萎靡，反应迟钝、目光呆滞，畏寒拱背，毛发黯黄、干枯脱落，小便量及死亡率明显增多。第 6 周后，大鼠进食、体重下降及死亡率较前逐渐改善。

HE染色,肾脏,肾小管,大鼠

西南医科大学硕士学位论文CKD+HP 组：第 4 周末肾小管显著扩张，管腔断裂，无正常肾小管结构存在；肾间质炎性细胞浸润，增生纤维化明显；其余病理改变同CKD 组。第 6 周及 8 周末与 CKD 组相比，CKD+HP 组肾脏结构紊乱、肾间质纤维化更严重（见图 3.2）。

HE染色,主动脉,大鼠,中膜

西南医科大学硕士学位论文大明显，出现节断性钙化结节，部分出现动脉瘤样改变，弹性较差，血管脆性增加。CKD+HP 组：第 4 周末大鼠主动脉弯曲、膨大明显，表面不光滑，多数大鼠形成钙化结节，第 6 周及 8 周末大鼠主动脉钙化结节更多，弹性极差，易脆。4.2 显微镜下病理改变CON 组：各时间点大鼠主动脉可见内膜、中膜、外膜三层完整的结构，管壁厚度正常，内皮光滑，中膜可见呈波浪状排列、规则连续的弹性纤维。见图 4.2。

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