YY1-hnRNPM通路在前列腺癌进展中的作用机制研究

发布时间：2020-08-05 06:42

【摘要】：目的探讨hnRNPM(核内不均一核糖核蛋白M)异常表达在前列腺癌进展过程中对EMT(上皮间质转化)的影响,并初步探讨其调节的分子机制。方法在Oncomine数据库中预测hnRNPM在正常前列腺组织和前列腺癌组织中的表达差异,利用RT-qPCR和Western blot检测hnRNPM在临床样本(前列腺癌与前列腺增生;前列腺癌与癌旁)以及LNCaP、C4-2、PC-3、DU145和H660细胞系间的表达差异,利用免疫组化检测hnRNPM在前列腺增生、前列腺腺癌及神经内分泌型前列腺癌中的表达差异;分别利用siRNA或shRNA及过表达质粒或过表达慢病毒在前列腺癌细胞系中敲低或过表达hnRNPM观察细胞形态的改变并利用划痕实验和transwell实验观察细胞侵袭性的变化并检测EMT相关标志物和上游转录因子的变化;利用PROMO和GeneCards数据库预测hnRNPM上游转录因子,并利用GeneCards、PROMO、LASAGNA和JASPAR数据库预测转录因子在hnRNPM启动子区域的结合位点;利用Oncomine数据库中预测YY1(Yin Yang 1)在正常前列腺组织和前列腺癌组织中的表达差异,利用TCGA数据库预测YY1与hnRNPM之间的相关性,利用免疫组化检测YY1在前列腺增生、前列腺腺癌及神经内分泌型前列腺癌中的表达差异;分别利用siRNA和过表达质粒在C4-2或PC-3细胞系中敲低或过表YY1,同时利用Western blot检测hnRNPM的表达变化;在C4-2细胞系中单独过表达YY1,过表达YY1的同时过表达hnRNPM,利用transwell实验分别观察细胞侵袭能力的变化,同时检测N-cadherin、Vimentin、Twist1的蛋白水平变化;针对数据库预测的YY1在hnRNPM启动子区域的两个结合位点,利用ChIP实验和双荧光素酶报告实验探索YY1通过结合hnRNPM启动子区域上的哪个位点发挥作用;分别在PC-3和DU145细胞系中转染hnRNPM过表达慢病毒,利用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系后,在此基础上转染含luciferase质粒的空载慢病毒,分别将筛选后的细胞接种至裸鼠腋下,待成瘤后将肿瘤取下,切成1mm~3左右瘤块原位种植于裸鼠前列腺部位,4-6周后利用小动物活体成像系统观察前列腺癌的转移情况。结果Oncomine数据库显示,hnRNPM在前列腺癌组织中的表达水平较正常组织低,与我们在临床标本中的检测结果一致。HnRNPM在前列腺癌组织中的表达水平较配对的癌旁组织低。HnRNPM在LNCaP、C4-2、PC-3、DU145和H660细胞系中的表达水平逐渐降低。免疫组化结果表明hnRNPM在前列腺增生、前列腺腺癌及神经内分泌型前列腺癌中的表达水平逐渐降低。在C4-2中敲低hnRNPM发现细胞形态(筛选稳转细胞株后)变瘦长,细胞的迁移和侵袭能力增强,与EMT增强相关的标志物表达增加,EMT上游转录因子Twist1表达增加。在PC-3中过表达hnRNPM发现细胞形态(筛选稳转细胞株后)变宽大,细胞的迁移和侵袭能力减弱,与EMT增强相关的标志物表达减少,EMT上游转录因子Twist1表达减少。通过数据库预测YY1可能为hnRNPM的上游转录因子,并且Oncomine数据库显示YY1在前列腺癌组织中的表达比正常前列腺组织中高。TCGA数据库显示,YY1与hnRNPM的表达呈负相关。免疫组化结果表明YY1在前列腺增生、前列腺腺癌和神经内分泌型前列腺癌中的表达水平逐渐升高。在C4-2中敲低YY1,hnRNPM表达升高。在PC-3中过表达YY1,hnRNPM表达降低。在C4-2中过表达YY1,细胞侵袭能力增强,N-cadherin、Vimentin、Twist1表达升高,过表达YY1的同时过表达hnRNPM,细胞侵袭能力部分减弱,N-cadherin、Vimentin、Twist1的表达也部分降低。针对数据库预测的YY1在hnRNPM启动子上的两个结合位点的双荧光素酶报告实验结果表明,YY1可主要通过结合位点2发挥对hnRNPM的转录抑制效应。动物实验表明,过表达hnRNPM可使前列腺癌的转移减少。结论HnRNPM在侵袭性较强的前列腺癌细胞系和转移性更强的神经内分泌型前列腺癌组织中表达较低,YY1可转录抑制hnRNPM从而导致Twist1表达升高,进而促进前列腺癌的上皮间质转化。我们认为hnRNPM可作为一种标志物辅助判断前列腺癌的转移和侵袭能力。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.25
【图文】：

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相关性利用 Spearman 相关性分析(SPSS 19.0, Inc.，USA被认为有显著统计学差异。按照 p<0.05 具有显著统计学差分为： *0.01≤p<0.05，**0.001≤p<0.01，***0.0001001，实验至少重复 3 次。NPM 在前列腺癌临床样本中的表达comine 数据库显示 hnRNPM 在前列腺癌样本中的表达较正显著降低确 hnRNPM 是否在前列腺癌的发生或进展过程中发挥着先利用 Oncomine 数据库（ Yu prostat.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE6919.）对 hnR达进行了预测，如图 1.1 所示 hnRNPM 在前列腺癌样本样本明显降低（p < 0.001）。

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1.2 hnRNPM 在前列腺癌组织和前列腺增生组织中的表还在接受前列腺癌根治术的 30 例患者术后标本中分别取esternblot 检测了 hnRNPM 在癌和癌旁中的表达，结果显RNPM 在前列腺癌组织中的表达比癌旁组织低（图 1.3）RNPM 在前列腺癌组织标本和前列腺癌癌旁组织标本中泌型前列腺癌（NEPC）是去势抵抗性前列腺癌（CRPC）

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天津医科大学博士学位论文图 1.2 hnRNPM 在前列腺癌组织和前列腺增生组织中的表达后我们还在接受前列腺癌根治术的 30 例患者术后标本中分别取癌利用 Westernblot 检测了 hnRNPM 在癌和癌旁中的表达，结果显示中，hnRNPM 在前列腺癌组织中的表达比癌旁组织低（图 1.3）。

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