【摘要】：背景和目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者较为常见的一种并发症,也是引起终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一。随着人们对糖尿病肾病的研究及认识,现在普遍认为糖尿病肾病是一种慢性炎症性疾病,长期微炎症状态使得肾脏肾小球及肾小管结构的改变,进而引发微量蛋白尿乃至大量蛋白尿。现在不少学者认为巨噬细胞在糖尿病肾病的发生发展中起到了重要作用。Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)是一种非受体型酪氨酸激酶,属于Tec激酶家族。近期研究表明,Btk是Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)等信号通路的重要的信号分子,参与并增强TLR信号转导并最终激活NF-κB和MAPKs信号通路,继而启动炎症反应。同时,Btk仅表达于除T淋巴细胞及组织浆细胞的髓系细胞,较TLR信号通路更有优势,本研究探讨Btk在糖尿病肾脏巨噬细胞激活及肾脏炎症中的作用及分子机制,为糖尿病肾病的治疗提供新的思路及措施。方法:第一部分:提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞,培养成熟后采用细胞流式技术对巨噬细胞进行鉴定。采用CCK-8法检测不同浓度的Btk抑制剂PCI-32765对巨噬细胞活性的影响,接着采用Western blot法检测在不同时间点和不同抑制剂浓度下p-Btk的相对表达量以优化实验条件。把巨噬细胞分为:低糖组(LG),抑制剂对照组(LG+PCI-32765),高糖组(HG),抑制剂组(HG+PCI-32765),刺激相应时间后收集细胞和上清,提取细胞m RNA及总蛋白。Transwell法观察巨噬细胞的趋化功能;ELISA法检测上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1浓度;实时定量PCR检测IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA表达水平;Western blot检测i NOS,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65,IκB,p-IκB等蛋白的表达;激光共聚焦法检测巨噬细胞的激活及NF-κB p65核转移。第二部分:选取Btk全髓系敲除小鼠及同背景野生型小鼠各14只作为研究对象,糖尿病组注射50mg/kg.d STZ连续5天,一周后检测各小鼠尾尖血糖,血糖≥16.7mmol/L则视为造模成功。该实验分为四组,分别为:野生型小鼠7只作为正常对照组(WT,n=7),糖尿病小鼠组(Diabetic,n=7),Btk敲基因小鼠组(Btk-/-,n=7)和Btk敲基因糖尿病小鼠组(Btk-/-diabetic,n=7)。12周后检测各小鼠体重、血糖、肾重,收集血、24小时尿及肾脏标本。酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠24小时尿蛋白排泄率;光镜观察小鼠肾脏病理变化;免疫组化方法检测IL-1β,MCP-1,激光共聚焦法检测CD68等;实时定量PCR检测IL-1β,MCP-1和TNF-α的表达;Western blot检测蛋白IL-1β,i NOS,TNF-α,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65的表达。结果:第一部分:细胞流式结果显示F4/80和CD11b双阳性的细胞占细胞总数的94.5%,细胞的纯度及成熟度均符合实验要求;实验条件优化后选择高糖的浓度为25mmol/L,PCI-32765的干预浓度为10-6mmol/L;Transwell趋化实验结果显示高糖刺激的巨噬细胞趋化的数目明显高于低糖组(P0.05),PCI-32765干预后细胞趋化数目较高糖组明显下降(P0.05);实时定量PCR结果显示,高糖组细胞IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA水平较低糖组细胞明显上升(P0.05),抑制剂组与高糖组相比,三者的m RNA水平明显下调(P0.05);ELISA结果显示,高糖组细胞上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1浓度较低糖组明显升高(P0.05),与高糖组相比,抑制剂组IL-1β,TNF-α和MCP-1浓度明显下降(P0.05);Western blot结果显示,与低糖组相比,蛋白i NOS,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB相对表达量明显升高(P0.05),抑制剂组与高糖组比,i NOS,p-Btk,p-ERK,p-NF-κB p65,p-IκB的表达明显下降(P0.05),p-ERK,p-JNK的表达未见明显变化(P0.05);激光共聚焦结果显示,高糖组巨噬细胞激活标志蛋白i NOS的表达和NF-κB p65核转移较低糖组明显升高,与高糖组相比,抑制剂组两者的表达则有所下降。第二部分:与WT组小鼠相比,糖尿病小鼠血糖、糖化血红蛋白、肾重/100g体重和24小时尿蛋白排泄率明显改变(P0.05),与Diabetic组相比,Btk-/-diabetic组24小时尿蛋白排泄率明显降低(P0.05),血糖、糖化血红蛋白和肾重/100g体重未发生明显改变;光镜下,Diabetic组小鼠较正常组小鼠肾脏肾小球体积增大,基底膜增厚,系膜细胞增殖,Btk-/-diabetic组小鼠较Diabetic组有所改善;实时定量PCR结果表明:Diabetic小鼠肾脏炎症因子较正常组表达明显升高(P0.05),Btk缺失后小鼠肾脏炎症水平较糖尿病小鼠明显下降(P0.05);免疫组化和激光共聚焦提示Diabetic小鼠肾脏巨噬细胞浸润明显增加,随着Btk敲除,肾脏巨噬细胞浸润明显减少;Western blot结果显示蛋白p-Btk,p-ERK,p-JNK,p-NF-κB p65,p-IκB在Diabetic组小鼠肾脏的表达较正常小鼠明显升高(P0.05),较Diabetic组小鼠,Btk-/-diabetic小鼠肾脏中这些蛋白的表达明显下降。结论:1在高糖刺激下,骨髓来源巨噬细胞激活,细胞内p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB表达上调,炎症因子IL-1β,MCP-1,TNF-α表达增加;Btk敲除后抑制MAPK以及NF-κB信号通路激活,下调巨噬细胞炎症因子的表达。2在动物实验中,糖尿病小鼠肾脏p-Btk表达明显升高,24小时尿蛋白排泄率升高,肾小球出现肥大,基底膜增厚,外基质沉积等病理改变,除此之外肾脏炎症及巨噬细胞浸润激活增加,Btk敲除后该现象有所改善,提示Btk可能参与了糖尿病肾病的发生发展;3糖尿病小鼠肾组织,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB的表达明显上调,炎症因子IL-1β,TNF-α和MCP-1合成增加,Btk敲除后下调MAPK,NF-κB信号通路以及炎症因子的表达,提示Btk致糖尿病肾损伤发生的机制可能与MAPK以及NF-κB信号通路激活有关;
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：
32髓来源巨噬细胞的纯度检测糖对 BMMs 活化的影响图 2 结果所示，采用 Western blot 法检测不同葡萄糖浓度对巨噬细胞其中使用甘露醇将各组渗透压调整至一致。当葡萄糖终浓度为 30mm胞活化的标志蛋白 iNOS 表达达到高峰(P<0.05)，在此高糖浓度下蛋生磷酸化(P<0.05)，因此在后续的实验中，葡萄糖终浓度定为 30mm
同浓度高糖对 BMMs 活化的影响糖浓度为 5mmol/L 相比，*P<0.05制剂 PCI-32765 对 BMMs 活性的影响CK-8 法检测不同浓度的 Btk 抑制剂 PCI-32765 对巨噬细胞活性的见当 PCI-32765 的浓度在 10-8~10-5mM 范围时，PCI-32765 对巨噬，当浓度达到 10-4mM 时，PCI-32765 对高糖刺激的巨噬细胞的活)。
不同浓度高糖对 BMMs 活化的影响萄糖浓度为 5mmol/L 相比，*P<0.05抑制剂 PCI-32765 对 BMMs 活性的影响 CCK-8 法检测不同浓度的 Btk 抑制剂 PCI-32765 对巨噬细胞活性的影见当 PCI-32765 的浓度在 10-8~10-5mM 范围时，PCI-32765 对巨噬细，当浓度达到 10-4mM 时，PCI-32765 对高糖刺激的巨噬细胞的活性05)。
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本文编号：2781366
