活性维生素D对D-半乳糖诱导的老年雄性大鼠睾丸功能影响的研究

发布时间：2020-08-05 11:01

【摘要】：背景衰老(aging)是一个随着时间增长,在机体的分子、细胞、组织、器官和系统各个水平中发生的不可逆的变化过程。在衰老的过程中,有相当比例的男性随着年龄的增长逐渐出现睾丸内分泌功能减退,体内雄激素水平的下降,患者出现性欲减退、勃起功能障碍、劳动耐力下降、骨质疏松、体脂增加、认知功能和记忆力下降,称为男性迟发型性腺功能减退(LOH),这严重影响了该类患者的生活水平和质量。男性性腺功能的下降与生殖系统内氧化应激损伤加重,抗氧化能力下降密切相关,已成为目前研究热点。维生素D3与男性生殖关系密切。大量研究证实,维生素D受体(VDR)及维生素代谢酶被发现存在于睾丸间质细胞、支持细胞、生殖细胞、精子及男性生殖道上皮中。多项临床研究揭示,血清25(OH)D水平与体内总睾酮和游离睾酮呈正相关。对于VDR缺失的裸鼠,精子数量和活力明显降低,从而导致不育。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路是机体内源性抗氧化应激的关键通路。在氧化应激状态下,Nrf2转位进入细胞核内,识别抗氧化反应原件(ARE),进而启动下游一系列靶基因的转录,调控II相代谢酶、抗氧化酶,如谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、超氧化物歧化酶(SOD)、血红素加氧酶1(HO-1)、葡糖糖醛酸转移酶1A6(NQO1)等的转录活性,从而发挥抗氧化损伤的作用。研究显示,Nrf2基因敲除的小鼠加速了年龄相关的精子生成障碍及睾酮水平的降低,提示Nrf2在机体生殖系统氧化损伤中的关键作用。研究显示,维生素D可激活Nrf2通路,延缓糖尿病肾病、支气管哮喘等多种疾病引起的氧化应激损伤。综上所述,维生素D是否也可通过激活睾丸组织Nrf2-ARE通路,加强Nrf2作用,进而调节下游抗氧化蛋白的表达,改善老年大鼠睾丸功能减退?本研究通过D-半乳糖(D-gal)皮下注射构建大鼠亚急性衰老模型,分别予不同剂量的维生素D处理,旨在研究活性维生素D对老年大鼠睾丸功能及氧化应激水平的影响,并探究其是否通过Nrf2/ARE通路发挥作用。目的观察活性维生素D对亚急性衰老大鼠睾丸功能的影响,并初步探究活性维生素D与睾丸氧化应激损伤的关系。方法8周龄雄性SD大鼠,随机分为两组,一组连续8周颈背部皮下注射15%D-半乳糖溶液500mg/(kg*d)制造亚急性衰老模型,另一组皮下注射等剂量的生理盐水作为正常对照。将造模成功后的亚急性衰老模型大鼠随机分为衰老模型组(DG)、衰老+低剂量维生素D组(LD)、衰老+高剂量维生素D组(HD),将正常对照组随机分为正常对照组(NC)、正常+低剂量维生素D组(LC)、正常+高剂量维生素D组(HC)。LD组、LC组予骨化三醇0.025ug/(kg*d)溶于花生油灌胃,HD组、HC组予骨化三醇0.1ug/(kg*d)溶于花生油灌胃,DG组、NC组予等量的花生油作为对照。8周后处死大鼠,分别称量体重、睾丸重量;取静脉血行生化、性激素检测;取大鼠附睾行精子参数分析;分光光度计法检测睾丸组织SOD、MDA含量;Western Blot检测睾丸组织VDR、Nrf2、GCLC、SOD2蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测Nrf2 mRNA的表达;大鼠睾丸组织中性甲醛固定后行HE染色观察形态学变化,免疫组化、免疫荧光检测VDR、Nrf2蛋白的表达及定位。结果1.亚急性衰老模型的评价与正常对照组相比,衰老模型组在注射D-半乳糖溶液后逐渐出现行动迟缓,毛发发黄,且褪毛严重。注射D-半乳糖溶液8周后,处死大鼠,可观察到胸腺指数、肝脏指数较正常对照组下降。睾丸指数下降,血睾酮水平降低。2.活性维生素D对各组大鼠一般情况及睾酮水平的影响DG组与NC组相比,睾丸重量明显下降(P0.05),睾丸指数(睾丸重量/体重)下降(P0.05)。补充维生素D之后可见,LD组和HD组睾丸重量和睾丸指数较DG组有所增加(P0.05)。LD组和HD组,LC组和HC组,各组间睾丸重量以及睾丸指数未见差异(P0.05)。各组间体重未见明显差异(P0.05)。与NC组相比,DG组睾酮显著下降(P0.05),补充维生素D后可见HD和LD组,睾酮水平有所增加(P0.05)。DG组血钙水平较NC组无明显差异(P0.05),LD组及HD组较DG组血钙水平升高,LC组和HC组较NC组血钙水平升高(P0.05)。血磷水平各组间无统计学差异(P0.05)。3.活性维生素D对各组大鼠精子参数的比较与NC组相比,DG组精子总数以及精子活动度下降(P0.05),补充维生素D后可见精子总数增加,活精子数增加(P0.05)。4.活性维生素D对各组大鼠睾丸组织SOD及MDA的影响与NC组相比,DG组SOD酶活力下降(P0.05),补充维生素D后可见SOD酶活力增强(P0.05)。与NC组相比,DG组MDA含量增加(P0.05),补充活性维生素D后可见MDA含量下降(P0.05)。5.活性维生素D对各组大鼠睾丸结构的比较HE染色可见,DG组大鼠睾丸组织生精小管萎缩,细胞层数减少,曲细精管管径缩小,管间间隙增宽,管内精子数目较少,间质区可见睾丸间质细胞稀少,间质增生。NC组大鼠睾丸组织结构完整,曲细精管饱满,管壁厚,生精细胞排列有序,管间含有丰富的精子。6.活性维生素D对各组大鼠睾丸组织Nrf2 mRNA的影响PT-PCR结果显示,与NC组相比,DG组Nrf2 mRNA表达水平下降(P0.05),补充维生素D后,可见LD组、HD组Nrf2 mRNA表达水平上升(P0.05);LC组、HC组Nrf2 mRNA水平较NC组上升(P0.05)。7.活性维生素D对各组大鼠睾丸组织VDR、Nrf2、SOD2、GCLC蛋白的比较与NC组相比,DG组Nrf2、SOD2、GCLC蛋白水平下降(P0.05),补充维生素D后可见LD组、HD组VDR、Nrf2、SOD2、GCLC蛋白水平较DG组上升(P0.05)。8.各组大鼠睾丸组织VDR、Nrf2的表达及定位的比较免疫组化及荧光结果显示,VDR、Nrf2均表达于各组精细胞及精子中,细胞核和细胞浆中均有表达。与NC组相比,DG组睾丸组织中VDR、Nrf2蛋白表达下降,补充维生素D后可见,LD组、HD组睾丸组织VDR、Nrf2蛋白升高。结论活性维生素D可改善D-半乳糖诱导的老年雄性大鼠睾丸功能减退。其机制可能是通过增强Nrf2介导的抗氧化应激水平来实现的。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R697.22
【图文】：

大鼠精子,活性维生素D,衰老模型,氧化应激

图 1 活性维生素 D 对各组大鼠精子参数的比较与衰老模型组相比，*P<0.05，与正常对照组相比，#P<0.05A B图 2 各组大鼠氧化应激水平的比较与衰老模型组相比，*P<0.05，与正常对照组相比，#P<0.05

氧化应激,大鼠精子,大鼠,衰老模型

各组大鼠氧化应激水平的比较

HE染色

各组大鼠睾丸组织HE染色结果（×100）

【参考文献】