低剂量地西他滨增强基底样膀胱癌化疗疗效的作用与机制研究

发布时间：2020-08-06 12:09

【摘要】：研究背景:膀胱癌(Bladder Cancer,BCa)是最常见的泌尿系肿瘤,并伴随极差的预后。手术治疗外,基于铂类药物的化疗仍然是目前治疗膀胱癌的主要方法。肿瘤干细胞(CSCs)与肿瘤的发生,复发,转移和耐药性有关。以DNA甲基化为代表的表观遗传学调控对于肿瘤干细胞的干性维持具有重要意义,DNA甲基化的生成需要甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的参与,用DNA甲基化抑制剂地西他滨(Decitabine,DAC)进行低剂量治疗已被证明适用于某些类型癌症的治疗。因此低剂量DAC在包括膀胱癌在内的实体瘤治疗中具有值得期待的前景。然而,其抗肿瘤作用和机制依赖于环境,其活性从未在膀胱癌治疗中进行过系统研究。本研究通过体内和体外研究探索低剂量地西他滨与化疗药物联用对于膀胱癌尤其是膀胱癌干细胞的疗效和机制,为临床用药提供新线索。研究目的:本研究使用BBN诱导的BCa小鼠模型,在体内和体外水平明确低剂量地西他滨与化疗药物联用对于膀胱癌的治疗效应和分子机制。采用最新的生命医学研究手段,系统地研究临床常用化疗药物的细胞杀伤和耐药形成机制,发展有效的多种不同类型药物联用方案,精准地指导临床化疗用药。研究方法:首先,本课题组使用先前建立的与人类疾病具有高度分子相似性的BBN(N-butyl-N-4-hydroxybutyl Nitrosamine)诱导的Krt14~(CreER);Rosa~(EGFP)和Sox2~(CreERT2);R26~(tdTomato)小鼠生成膀胱癌模型,对其使用了甲基转移酶抑制剂DAC和两种化疗药,吉西他滨和顺铂进行治疗。在BBN诱导了26周后,我们分别用了这三种药物进行单独治疗,或分别使用DAC与另外两种化疗药联合治疗的方案,30周后处死小鼠。以评估不同药物组合对膀胱癌的治疗效果。另外,我们用他莫昔芬诱导K14creGFP小鼠表达GFP,诱导Sox2creTomato小鼠表达Tomato,进行谱系追踪实验,进一步分析不同药物组合对膀胱癌干细胞的影响。在体外实验中,我们用100nM的DAC处理膀胱癌细胞系,进行以下表型检测:凋亡、对于顺铂和吉西他滨的敏感性(IC_(50))、肿瘤干细胞比例及肿瘤干细胞成球数量,确认低剂量DAC处理在体外对于膀胱癌细胞的杀伤效果;我们进行甲基化DNA免疫沉淀(MEDIP)测序以及mRNA-seq筛选参与DAC在BCa细胞中的药物作用的靶基因和信号通路,Bisulfite-PCR和实时定量PCR确认DAC处理对于该靶基因的影响。最后通过人源异种移植物(PDX)模型评估不同药物组合的临床相关性。研究结果:在这项研究中,我们证明了对于BBN诱导的小鼠模型和膀胱癌细胞系,低剂量DAC联合顺铂或吉西他滨治疗显示出比单药处理更好的抗肿瘤效果。重要的是,我们发现低剂量DAC和顺铂或吉西他滨的组合可以抑制CSCs在体内的自我更新能力,并在体外降低了ALDH+和CD44V6+干细胞的比例及其成球能力,抑制CSCs对顺铂和吉西他滨的化学抗性。甲基化DNA免疫沉淀(MEDIP)测序及表达组测序综合分析筛选出了参与DAC在BCa细胞中的药物作用的靶基因SOCS3,及其参与的信号通路STAT3信号通路,低剂量DAC可以使SOCS3的DNA去甲基化和再激活。低剂量地西他宾联合化疗在源自人患者样品的异种移植瘤中同样显示出较好的疗效,进一步验证了以上研究结果的临床相关性。研究结论:本研究首次在体内和体外发现低剂量DAC治疗通过抑制BCa干细胞的干性来提高顺铂和吉西他滨治疗BCa的功效,通过抑制STAT3信号通路抑制BCa中CSCs的自我更新能力。我们的研究结果揭示了一种潜在促进BCa化疗临床疗效的全新治疗方法。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14
【图文】：

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实验策略示意图：BBN 诱导 Krt14CreER; Rosa26EGFP 小鼠 26 周后进行莫昔芬连续注射 3 天后处死。3.1.1 Schematic diagrams show the experimental strategies. Chemotherapeuticsrated to Krt14CreER; Rosa26EGFP mice after 26 weeks of BBN treatment andwas injected for 3 consecutive days before sacrifice.表 5 动物实验分组和药物处理方式Table 5Animal experiment grouping and drug treatment对照组顺铂吉西他滨地西他滨顺铂+地西他滨吉西他滨滨导PBS注射Cis 注射次Gem 注射次DAC 注射连续 5天DAC 注射连续 5天+ Cis 注射次DAC 注射天+ Gem次导PBS注射Cis 注射次Gem 注射次DAC 注射连续 3天DAC 注射连续 3天+ Cis 注射次DAC 注射天+ Gem次导PBS注射Cis 注射次Gem 注射次DAC 注射连续 5天DAC 注射连续 5天+ Cis 注射次DAC 注射天+ Gem次导PBSDAC 注DAC 注射连续 3DAC 注射

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.2 通过组织病理学确定不同治疗组的侵润性 BCa of invasive BCa development as determined by histotreatment groups.膀胱重量/体重经单因素方差分析，然后 Bonferro p <0.05，**p <0.01；相对于顺铂/吉西他滨治疗组<0.01）lculated as (gross bladder weight/body weight) 100%eatment, #p < 0.05, ##p < 0.01 relative to cisplatin/gne wayANOVAfollowed by Bonferroni Multiple Co剂量 DAC 在体内 BCa 治疗中的效果，我们

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膀胱重量/体重经单因素方差分析，然后 Bonferro p <0.05，**p <0.01；相对于顺铂/吉西他滨治疗组<0.01）lculated as (gross bladder weight/body weight) 100%eatment, #p < 0.05, ##p < 0.01 relative to cisplatin/gene wayANOVAfollowed by Bonferroni Multiple Co剂量 DAC 在体内 BCa 治疗中的效果，我们度分子相似性的 BBN 诱导膀胱癌的小鼠模病诊断治疗指南》（人民卫生出版社，2011括顺铂和吉西他滨等，因此本研究中运用了2 只 Krt14CreER; RosaEGFP雄性小鼠被随机分成加入 BBN ，诱导 26 周生成肿瘤后。分别tabine 的单药或组合用药进行治疗（Fig 3.1.生率（Fig 3.1.2），发现模拟治疗组（空白侵润性 BCa，而在顺铂，吉西他滨和 DAC 单

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