高磷诱导胆固醇敏感器SCAP功能失调促进血管平滑肌细胞泡沫化

发布时间：2020-09-21 09:48

　　 第一部分高磷诱导VSMCs内胆固醇蓄积目的:慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)患者并发的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)性疾病是其最主要的并发症和死亡原因。新近研究表明血磷与胆固醇可能具有相似的致动脉粥样硬化作用。血管平滑肌细胞源性泡沫细胞形成是动脉粥样硬化的基本病理过程,为了探讨高磷是否通过干扰胆固醇代谢致动脉粥样硬化的发生,我们在高磷诱导原代人血管平滑肌细胞(Vasclar Smooth Muscle Cells,VSMCs)观察其细胞内胆固醇蓄积情况。方法:①建立高磷血症VSMCs细胞模型:将6-8代原代人VSMCs分为5组,在2%FBS的M199培养基中饥饿处理24小时,再分别以梯度磷浓度:1.Ommol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L、5.0mmol/L处理24小时后,常规提取VSMCs总蛋白,以Western blotting法检测SCAP及HMGCR蛋白的表达。②将6-8代原代人VSMCs分为对照组及高磷组在常规饥饿处理后,对照组以磷浓度1.Ommol/L、高磷组以磷浓度3.0mmol/L的2%FBS M199培养基处理24小时后,油红O染色法观察VSMCs内中性脂质蓄积情况,酶法定量法测定VSMCs内胆固醇含量,Real time PCR及Western blotting法测定细胞内SCAP、HMGCR和SREBP2 mRNA及其蛋白的表达。结果:①通过不同磷浓度梯度干预VSMCs,Western blotting结果显示:磷呈剂量依赖性地上调VSMCs内SCAP及HMGCR蛋白的表达。②细胞爬片油红O染色结果显示:高磷组VSMCs内中性脂质颗粒较对照组明显增多;酶法定量法测定VSMCs内胆固醇含量结果显示:高磷组VSMCs内总胆固醇及游离胆固醇明显高于对照组(P0.05);③ Western blotting 结果显示:高磷组 SCAP、HMGCR、N-SREBP2蛋白水平明显高于对照组。Real time PCR结果显示:高磷组HMGCR(P0.05)、LDLr(P0.05)及 SREBP2(P0.01)mRNA 的表达明显增加。结论:磷能够呈剂量依赖性上调VSMCs内SCAP及HMGCR蛋白的表达。实验结果发现在磷3.0mmol/L条件下,细胞内胆固醇聚集明显增多,且胆固醇代谢相关蛋白SCAP、HMGCR、N-SREBP2表达相应升高,其中HMGCR、SREBP2及LDLr基因转录增强。而SCAP和N-SREBP2蛋白是细胞内胆固醇稳态调节机制(LDLr负反馈调节)中的关键蛋白,HMGCR为细胞内胆固醇合成代谢的限速酶。这些现象提示CKD患者并发高磷血症后,高磷通过某种机制诱导胆固醇代谢紊乱致血管平滑肌细胞泡沫化,进而引发动脉粥样硬化性疾病。第二部分高磷诱导胆固醇敏感器SCAP功能失调促进VSMCs泡沫化目的:前期工作中已证实高磷导致的VSMCs内胆固醇蓄积可能与SCAP介导的胆固醇稳态负反馈调节失常密切相关。正常生理状态下胆固醇负反馈调节系统主要通过Insig-SCAP-SREBPs的相互作用实现细胞内胆固醇稳态平衡。其中SCAP从内质网转位至高尔基体是至关重要的一步,有研究显示炎症导致的外周细胞内胆固醇大量聚集即通过诱导SCAP上调实现。高磷是否也通过相同的路径扰乱胆固醇代谢?因此本实验使用特异性pit1/2通道阻断剂(PFA)及特异性抑制SCAP由内质网向高尔基体转位化合物(Betulin),对VSMCs磷的摄取和SCAP转位的水平进行干预,进一步探究高磷是否在细胞内诱导SCAP功能失调致VSMCs泡沫化。方法:将实验细胞VSMCs分为6组即:对照组、高磷组、PFA组、PFA+高磷组、Betulin组、Betulin+高磷组。常规饥饿处理后将分别予以对照组:PBS,高磷组:磷 3.0mmol/L,PFA 组:PFA1.0mmol/L,PFA+高磷组:PFA 1.0mmol/L+磷 3.Ommol/L,Betulin 组:Betulin 3.0μg/mL,Betulin+ 高磷组:Betulin 3.0μg/mL+ 磷 3.Ommol/L 2%FBS M199培养基处理24小时后,用油红O染色法检测VSMCs内中性脂质颗粒聚集情况;以酶法定量法检测VSMCs内胆固醇含量;Realtime PCR 检测 VSMCs 内 HMGCR、LDLr、SREBP2 以及 SCAP mRNA 的表达。结果:油红O结果显示:PFA组与对照组VSNCs内中性脂质颗粒无明显差异,而PFA+高磷组相较于高磷组其VSMCs内的中性脂质颗粒明显减少。Betulin组VSMCs内的中性脂质颗粒聚集程度与对照组相似,Betulin+高磷组VSMCs内的中性脂质颗粒明显少于高磷组。酶法定量结果显示:PFA组与对照组细胞内胆固醇含量差异无统计学意义,PFA+高磷组细胞内胆固醇较高磷组明显减少(总胆固醇及游离胆固醇均P0.05)。Betulin组细胞内胆固醇含量较对照组明显减少(总胆固醇P0.05;游离胆固醇P0.01);Betulin+高磷组较高磷组细胞内胆固醇也明显减少(总胆固醇及游离胆固醇均P0.05)。Real time PCR 结果显示:高磷+PFA 组 HMGCR、LDLr 及 SREBP2 mRNA表达明显低于高磷组(均P0.05);Betulin组HMGCR、LDLr mRNA表达较对照组明显降低(P0.05);高磷+Betulin组HMGCR、LDLr及SREBP2 mRNA表达与高磷组相比明显降低(HMGCR及LDLrP0.01;SREBP2 P0.05)。SCAP 在 PFA 或者 Betulin 作用下其mRNA无明显变化。结论:高磷状态下PFA阻断磷进入细胞后,细胞内胆固醇明显减少,这说明高磷状态下磷需进入细胞内才能实现对胆固醇代谢的干扰作用。SCAP转位过程被抑制后,高磷引起的细胞内脂质大量蓄积被明显削弱,这一现象说明高磷通过干扰SCAP的功能,从而引起VSMCs泡沫化。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：

ＶＳＭＣｓ内中性脂质颗粒分布密度与对照组无明显差异，而高磷条件下加逡逑入ＰＦＡ干预后，原高磷条件下细胞内大量聚集中性脂质的情况消失，红色颗粒变逡逑得又小又稀少。（如图２ａ）。逡逑＂ｉ邋＼逦．逡逑、：，‘逦、＇ｋ、八ｒ逦，一邋１逦＇逦＊？．．，逡逑？邋＊逦＇邋ｉ逦Ｉ邋＜逦Ａ逦“逡逑Ｃｔｒｌ逦Ｐ逦ＰＦＡ逦Ｐ＋ＰＦＡ逡逑图２ａ？高磷＋ＰＦＡ干预原代人ＶＳＭＣｓ油红Ｏ染色结果（ｘ２００）逡逑ｒｉｇ，２ａ．邋Ｏｉｌ邋ｒｅｄ邋Ｏ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｈｉｇｈ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ邋＋邋ＰＦＡ邋ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｈｕｍａｎ逡逑ＶＳＭＣｓ邋（ｘ２００）逡逑在含抗氧化剂ＥＤＴＡ邋（１００哗ｏｉ／Ｌ）、丁羟甲苯ＱＯｐｍｏＩ／Ｌ）和２％ＦＢＳ的逡逑Ｍ１９９培养基中饥饿处理原代人ＶＳＭＣｓ细胞爬片２４小时，使用ＰＢＳ邋（对照组）、逡逑磷邋３．０ｍｍｏｌ／Ｌ邋（高磷组）、ＰＦＡ１．０ｍｍｏｌ／Ｌ邋和磷邋３．０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＰＦＡ１．０ｍｍｏｌ／Ｌ邋处理邋２４逡逑小时。细胞用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，油红０染色，苏木素复染，光镜下观察（ｘ２００）。逡逑４．２高磷ＰＦＡ干预ＶＳＭＣｓ后细胞内胆固醇测定逡逑在正常磷水平下利用ＰＦＡ处理ＶＳＭＣｓ后，细胞内胆固醇含量与对照组相比逡逑无明显差异（Ｐ＞0．0５）

高磷条件下使用Ｂｅｔｕｌｉｎ后，高磷诱导的细胞内中性脂质蓄积现象被明显削逡逑弱。且在磷离子水平正常情况下，Ｂｅｔｕｌｉｎ对细胞内中性脂质颗粒蓄积无明显影响。逡逑使用Ｂｅｔｕｌｉｎ前后中性脂质在细胞内的分布区域一致（如图２ｄ）。逡逑＇、？邋Ｖ邋１邋ｉｉ逦＊邋ｒ邋＇邋？邋？逦｜．邋，逦＼逦＊邋＊逡逑，、＃逦０邋ｊ邋，邋广邋“Ｉ邋（、逦’逦？逡逑ｉ＇邋＾逦■逦一身？邋－逦、、逦？逦，，逦４逦－逡逑Ｖ逦＊逦＾逦＂邋ｒ逦鍪逦．？逦，／邋：逦＊逦＼逡逑，０逦－邋＾逦－逦＊邋１逦＊逦．N

本文编号：2823354