利用后肾移植与脱细胞支架进行肾脏再生及对比分析研究

发布时间：2020-10-17 06:05

　　 终末期肾病在世界范围内的发病率逐年升高,据统计,我国现有超过100万的终末期肾病病人。终末期肾病主要有两种治疗方式:透析和肾脏移植,透析只能部分替代肾脏功能,且会引起心血管疾病、骨病等众多并发症,透析患者的长期存活率及生活质量较低,此外高额的透析费用也为个人、社会和卫生系统都带了巨大的经济负担。肾脏移植是目前治疗终末期肾病最佳方法,但肾源短缺和移植后免疫排斥问题等严重制约了其广泛应用,我国现有透析等待肾脏移植的患者120万,每年以十几万的数量增加,每年仅有5000个左右病人能有机会接受肾脏移植术,大量的病人在等待中经受痛苦或死亡。因此,全器官肾脏再生研究最有希望能解决这一临床问题。近年来干细胞领域的研究发展迅速,多能干细胞具有多种分化能力和无限增殖能力,可以自我更新,在不同的条件下可以分化为不同的人体组织或器官的细胞。最新的研究成果表明已经可以将干细胞体外诱导分化产生人肾脏祖细胞,包括中间中胚层(IM)细胞和后肾间充质(MM)细胞,继续将肾脏祖细胞与胚胎脊髓体外共培养,可诱导产生出具有明显肾小管和肾小球特征的3D肾脏结构。因此多能干细胞在肾脏再生领域有很好的应用前景。从多能干细胞到再生出肾脏,我们须从发育生物学角度入手,充分了解肾脏的发生发育过程及其分子调控机制。哺乳动物的肾脏发育起源于中胚层,由体节外侧的细胞形成生肾索,生肾索头部发育为前肾,中部发育为中肾,尾部发育为后肾。前肾和中肾随着胚胎的发育逐渐退化,而后肾最终发育为成体肾脏。肾脏发生从管状前体细胞团开始,在Wnt9b、Pax8、Fgf8、Wnt4的作用下,细胞团快速增殖到30细胞左右,接下来Wnt4维持着Pax8、Fgf8、Lhx1等基因的持续表达,促使细胞团变成了小泡体,随后Brn1/Pou3f3转录因子高表达,小泡体继续发育为逗号小体和S小体,足状突细胞在Wt1的作用下发育成为足细胞,近、远端小管前体细胞则形成复杂的缠绕,与集合管融合在一起。目前基于干细胞的肾脏再生研究主要有六种策略:胚胎后肾移植、肾脏脱细胞支架再灌注、囊胚互补、体外诱导干细胞生成肾脏类器官、后肾微环境诱导干细胞向肾系细胞分化以及生物人工肾等,这六种方法均能再生出肾系细胞,有的甚至能发挥部分肾功能,但均因血管化不足、免疫排斥、细胞数量不足等原因,不能再生出完整肾脏。囊胚互补方法是在sall1基因缺失小鼠的囊胚阶段,注射外源干细胞进入囊胚腔,使外源干细胞与囊胚共同发育,形成嵌合体,进而获得由外源干细胞为主要细胞构成成分的肾脏,此方法可获得形态完整的肾脏且细胞来源可控,但由于sall1基因调控肾脏发育并不影响血管生成,所以再生肾脏的血管系统来源于嵌合体,且由于囊胚期注射外源干细胞,嵌合体的动物带来了严峻的伦理问题。直接诱导多能干细胞/胚胎干细胞定向分化为肾细胞,干细胞具有多能性,在体内可以向任何细胞类型分化,并自我组装成组织器官。通过向培养基中添加多种生长因子,诱导干细胞向肾系细胞分化,并利用3D培养方法,培养出具有3D结构的肾脏组织。缺点是分化效率较低,无法实现血管化,最新的研究成果显示,将体外诱导PSCs分化成的类肾器官移植入裸鼠皮下,成功发育出血管化的有功能的“小型肾脏”,可以正常过滤血液并产生尿液,这是慢性肾病治疗史上一个重要的里程碑。利用后肾微环境诱导外源干细胞向肾系细胞分化,将标记的外源干细胞注射入胚胎肾脏发育的位置,使后肾微环境对外源干细胞进行诱导,可以获得来自外源细胞的嵌合体肾脏,但是获得的肾脏是胎肾,仍需后肾移植,且体外胚胎的培养技术难度较大,嵌合体的肾脏仍然有较大的免疫排斥以及伦理问题;生物人工肾是将再生医学和工程科学技术结合起来以创建结构和装置来代替丧失的组织或器官功能,肾小管辅助装置(RAD)由近曲小管细胞工程化组装而成,与常规血滤器和体外血液循环系统相比,RAD能够在尿毒症环境中维持尿毒症患者急性肾功能衰竭的生存能力。我们选取了后肾移植与脱细胞支架再灌注两种肾脏再生方法进行比较分析研究,分别阐述了两种肾脏再生方法的优势及劣势,总结了其研究困难与限制因素。胚胎期的肾脏具有强大的分化潜能,后肾阶段的细胞是处于胚胎期的肾脏前体细胞或者肾脏祖细胞,这些细胞除了具有发育多能性外,还有较低的免疫源性,首先,胚胎早期缺乏识别同种异体抗原或异种抗原的抗原呈递细胞(APCs)。第二,胚胎后肾组织细胞尚未表达Ⅰ类和Ⅱ类组织相容性抗原。第三,相对于成体组织,胚胎肾脏组织引起的免疫反应相对较轻。第四,所移植胚胎后肾血供将来源于受体,形成源于受体的血管床,从而减少免疫反应。有研究证实后肾移植可以发挥部分肾脏的分泌功能,分泌促红细胞生成素(EPO)和肾素;后肾移植可以在急性失血动物模型中有效地参与维持血压的稳定;后肾移植可以有效地抑制慢性肾衰动物模型的血管钙化;还有部分研究比较了体内各移植位点,包括大网膜、小肠、腹主动脉旁、肾动脉、膀胱、淋巴结,但是肾被膜下移植后肾的生长情况和功能发挥尚无报道,肾被膜下移植可以使得移植物与宿主肾脏聚在一起,1.随着后肾移植物在体内的发育,其可能会与原有肾脏发生融合,共同担负起肾脏功能;2.后肾移植物生长在肾被膜下,其集合系统可能会与原有肾脏共用,若不能,与宿主输尿管的对接吻合也较为方便;3.相比大网膜和腹主动脉移植,肾被膜下移植更为简易,可显著缩短手术时间,且不需开腹。因此,肾被膜作为新的移植位点值得深入研究。我们将胚胎期15天(E15)大鼠后肾剥离后,分别移植到单侧肾切除的A组大鼠大网膜中,B组肾被膜下,比较其生长发育状态,功能发挥情况。我们发现:1.两组中单侧肾切除的大鼠对侧肾脏显著增生;2.两组移植的后肾均在移植两周后显著生长;3.通过病理检测到移植物显著血管化且有明显的肾小球、肾小管等结构,免疫组化显示PAX2、CD31阳性,说明后肾可以在体内血管化并成长为成熟肾脏,OCT4、NANOG、SOX2阴性,说明后肾已经分化发育为成熟的肾系细胞,已经脱离干性,但两组之间的肾结构和血管化程度均没有显著差异;4.从移植物中收集到尿液,尿肌酐ELISA检测显示移植物均有部分肾功能但不完全,且两组之间没有显著差异。综上所述,后肾移植可以产生具备所有成体肾细胞类型的肾脏组织,经过宿主血管化后,可发挥一定的肾脏功能。与大网膜移植相比,肾被膜下移植的后肾无论是移植物大小还是血管化程度都没有明显差异,说明肾被膜可以作为新的后肾移植位点。后肾移植还在维持血压平衡、抑制血管钙化等发挥重要功能,因此后肾可以作为可移植肾脏的一个重要来源。近年来,以细胞生物学、材料学为基础的组织工程技术发展迅速,组织工程的三要素为种子细胞、生物材料和细胞与生物材料的结合。目前已经可以利用组织工程技术再生出多种解剖结构较为简单的组织,如骨骼、软骨、血管、膀胱等,这些组织在进行体内移植时对血管网络要求不高,但大器官例如心脏、肾脏等解剖结构十分复杂,需要严格的血管供应系统,简单的合成材料与种子细胞的结合不能实现器官再生。生物器官脱细胞支架为组织工程技术提供了更高级的生物材料,也为大器官的再生提供的新的希望,脱细胞支架是指通过物理、化学或两者结合的方法将器官中所有的细胞成分去除,留下器官的3D结构,主要成分为细胞为基质,此支架中含有大量细胞诱导因子,所以脱细胞支架可以为种子细胞提供微环境,诱导其定向分化。肾脏脱细胞支架已经在多种哺乳动物中成功制备,如大鼠、猪、猴等。有研究表明在体内将肾脏下极三分之一切除后,以肾脏脱细胞支架补足,4周后发现脱细胞支架成功诱导正常肾脏向下极再生。本研究结合多种脱细胞试剂,制备大鼠肾脏脱细胞支架,建立大鼠肾脏脱细胞支架制作平台及流程体系,然后以人脐静脉内皮细胞为种子细胞,人脐静脉内皮细胞是一种多能干细胞,具有向多种细胞类型分化的能力,利用流动持续灌注方法,向大鼠肾脏脱细胞支架中灌注种植人脐静脉内皮细胞,获得了具有一定结构及功能的肾脏,并检测了支架中细胞贴附和分化情况,评估再生肾脏的功能水平,为组织工程和肾脏再生提供了可靠的研究基础。通过对比分析后肾移植与脱细胞支架两种肾脏再生方法,我们发现后肾移植可以再生出成体肾的所有细胞类型,细胞数量和血管化水平上也优于脱细胞支架方法,但是仍然有许多关键性问题没有解决,例如后肾移植应用到人类后,存在伦理问题,后肾移植物的长期存活情况尚无报道。脱细胞支架再生的肾脏大小更符合成体肾的尺寸,且动静脉血管保留良好,适合体内移植,但此方法目前主要的限制因素为细胞的贴附量不够,分布不均匀以及移植后的血栓预防问题。期待未来有一种肾脏再生方法能涵盖目前所有方法的优势,再生出完全功能的肾脏。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R699.2
【部分图文】：

图１．肾脏结构。??２．肾脏的发生、发育过程??哺乳动物的肾脏发育起源于中胚层，由体节外侧的细胞形成生肾索，生肾索??头部发育为前肾，中部发育为中肾，尾部发育为后肾。前肾和中肾随着胚胎的发??

图２．后肾早期发育过程。??Ｗｎｔ４由管状前体细胞团表达，以自分泌的方式在Ｗｎｔ信号通路早期发挥作??用，它促进了管状前体细胞团向小泡体方向发育。Ｗｎｔ９ｂ和Ｗｎｔ４都是通过经典??的０心〖６１１丨１１信号通路发挥作用［３９，４〇］，有研究表明当＼＾加４发生突变，＼＾１％??

图３．肾脏再生的六种方法
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 张永;组织工程学在生物人工肾小管研究中的应用[J];生物医学工程学杂志;2002年01期

本文编号：2844392