miR-543通过靶向Numb促进前列腺癌细胞增殖、转移和干性特征的研究

发布时间：2020-10-31 00:46

　　 研究背景:越来越多的研究表明,miRNAs是多种肿瘤重要的转录后调节因子,在肿瘤的发生、发展以及转移过程中起着重要的作用。据报道,miR-543通过促进前列腺癌的生长在前列腺癌中扮演着促癌基因的角色,然而miR-543调控前列腺癌细胞的增殖、转移和干性特性的研究以及其具体机制尚未被阐述。研究目的:探讨miR-543促进前列腺癌细胞增殖、转移以及干性特征的相关分子机制,从而探讨前列腺癌复发转移的相关分子生物学机制,期待为前列腺癌新的治疗手段提供坚实的理论基础。研究方法:本实验采用荧光定量PCR检测前列腺癌CD44~+PC3、CD44~-PC3、CD44~+Du145、CD44~-Du145细胞中miR-543的表达水平。分别向DU145和PC3细胞系转染miR-543的模拟剂、抑制剂后,采用荧光定量PCR检测miR-543、Numb以及干细胞相关的标记分子的表达情况;Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;克隆形成实验检测细胞的增殖能力;利用干细胞悬浮成球和3-D matrigel成球实验技术检测前列腺癌干细胞相关特性;以及利用Western Blot检测干细胞相关蛋白的表达。在CD44~+前列腺癌细胞中过表达Numb或者在CD44~-前列腺癌细胞中敲低Numb后,采用平板克隆、悬浮成球、Transwell技术分别检测细胞的增殖、自我更新、迁移以及侵袭能力。生物信息学和双萤光素酶报告实验分别用来预测和验证Numb是否为miR-543的靶基因。同时,我们还构建含全部Numb cDNA序列但不含有Numb 3’UTR全部序列的过表达质粒,在PC3细胞中共转染Numb和miR-543。将转染miR-543后的PC3细胞系接种于免疫缺陷性小鼠皮下和尾静脉,观察小鼠皮下成瘤能力和尾静脉肺转移的情况。研究结果:CD44~+PC3和CD44~+Du145细胞miR543表达水平分别高于CD44~-PC3和CD44~-Du145细胞。前列腺癌细胞内转染模拟剂后miR-543表达明显高于对照组,而Numb的表达水平均低于对照组,miR-543过表达组细胞的侵袭、克隆形成、干细胞悬浮成球以及细胞贴壁非依耐性生长的能力高于对照组。转染抑制剂的前列腺癌细胞miR-543表达水平明显低于对照组,Numb的表达水平高于对照组,并且细胞侵袭能力、克隆形成能力、干细胞悬浮成球以及细胞贴壁非依耐性生长的能力明显下降。Western Blot结果显示miR-543过表达则Numb表达下调,miRNA敲低则Numb过表达,两者表达情况刚好相反。在CD44~-PC3细胞内敲低Numb后,细胞的侵袭能力、贴壁非依赖性生长以及干细胞悬浮成球能力均增加,在CD44~+PC3细胞中过表达Numb后,则出现相反的结果。双荧光素酶基因报告实验结果显示miR-543可抑制野生型Numb 3’UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型Numb 3’UTR的荧光素酶活性无影响,该结果与我们软件预测miR-543的靶基因的结果一致。PC3细胞共转染不含3’UTR的Numb过表达质粒和miR-543 mimic后,实验结果显示Numb过表达能够逆转miR-543的促癌作用。miR-543过表达后小鼠皮下成瘤体积明显增大,miR-543敲低则抑制小鼠皮下成瘤的大小。miR-543过表达后小鼠的肺转移能力也增强。研究结论:miR-543通过直接抑制Numb基因,正向的调控前列腺癌细胞增殖、转移以及干性特性,从而促进肿瘤的发生和转移,miR-543有望成为治疗前列腺癌转移的潜在靶点。
【学位单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

CD44+和 CD44-前列腺癌细胞中的表达差异。流式细胞分选 DU145 细胞，荧光定量 PCR 分别检测 CD44+PC3、DU145胞 miR-543 的表达。（**P<0.01）n of the expression of miR-543 in CD44+and CD44-prostate c were separated by flow cytometry. Fluorescence quantitative ssion of miR543 in CD44+prostate cancer cells and CD44-pr*P<0.01）1.4 讨论 30%的基因组能被转录，只有 1%的基因能编码蛋白因大部分转录后被称为非编码 RNA，其中 miRNA ，目前被发现的 miRNA 基因有成百上千种，它们参过程。近些年，miRNA 被发现在某些肿瘤内异常表癌基因的角色。但是目前大部分 miRNA 在癌症中发清楚或者并不完善。前面有人已经研究过 miR-543

阴性对照组前列腺癌细胞的克隆形成、细胞侵袭、贴壁非依耐性生长和悬浮成球能力的差异。当 P< 0.05 时认为差异具有统计学意义。2.3 结果2.3.1 miR-543 的模拟剂和抑制剂转染效率验证miR-543 mimic 和 inhibitor 是体内成熟的 miR-543 模拟物和抑制剂，可以模拟和抑制 miR-543 的生物学功能。Lipofactamine RNAiMAX 转染试剂的转染效率高。我们利用 LipofectamineRNAiMAX 转染试剂将 miR-543mimic、mimic-nc、inhibitor 和 inhibitor-nc 转染至 PC3 和 DU145 前列腺癌细胞株。48 小时后荧光定量 PCR 验证转染效率。转染 miR-543mimic 组的 PC3 细胞 miR-543 表达情况是对照组的 42.76±5.708 倍，转染 mimic 组的 DU145 细胞 miR-543 表达情况是对照组的 83.94±9.7 倍。转染 inhibitor543 组的 PC3 细胞 miR-543 表达情况是对照组的0.04667±0.004 倍，转染 inhibitor 543 组的 DU145 细胞 miR-543 表达情况是对照组的 0.0356±0.004 倍。差异均具有统计学意义。证明 miR-543 过表达和敲低体系构建成功。

48 小时后分别检测穿过上室的细胞，从而比较前列腺癌不同组细胞的侵袭能力。结果显示，过表达 miR-543 后，PC3 和 DU145 细胞侵袭能力比对照组侵袭能力增强（P=0.0107，P=0.0134），敲低 miR-543 后，PC3 和 DU145 细胞侵袭能受到抑制（P=0.0236，P=0.0219），差异均具有统计学意义。说明 miR-543 过表达促进前列腺癌激素非依耐性细胞（PC3、DU145 细胞）的侵袭转移。大量研究显示，肿瘤的启动和发展与 EMT 密切相关[37]，EMT 是一些癌症转移的关键调节因子，具有侵袭性表型。在促进转移的同时，EMT 过程被认为能产生肿瘤干细胞，并且 EMT 与肿瘤的治疗抵抗密切相关[38]。于是我们猜想 miR-543 促进前列腺癌细胞的侵袭是否与 EMT 相关，因为 EMT 也是肿瘤细胞维持干性特征的因素之一。利用 WB 检测 miR-543 过表达后 EMT 相关分子的表达情况。实验结果显示，miR-543 过表达的 PC3 和 DU145 细胞比对照组的上皮表型E-cadherin 分子表达明显降低，miR-543 过表达的 PC3 和 DU145 细胞比对照组的间质表型 Vimentin 分子表达明显增加。说明 miR-543 促进前列腺癌细胞的侵袭能力归因于或者至少部分归因于 miR-543 参与 EMT 的调控，EMT 与肿瘤干细胞的干性是密切相关。
【相似文献】

相关期刊论文 前4条

1 蒋婉莹;袁海建;宋添谋;韦定玲;杨阳;阙海涛;梅广红;;miR-543调控肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭的机制分析[J];临床和实验医学杂志;2019年18期

2 郭吉喆;赫倩茹;刘丽波;阮雪蕾;马珺;薛一雪;;HCG11靶向结合miR-543调节血肿瘤屏障通透性[J];解剖科学进展;2018年06期

3 赵云东;宋玉琴;刘娜;孙冬弢;;miR-543对胶质瘤SHG-44细胞侵袭、迁移的影响及机制研究[J];宁夏医科大学学报;2018年07期

4 孙玲;鹿军;李弹弹;门丽杰;李传翠;;MiR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控及其机制研究[J];中国实验血液学杂志;2019年03期

相关博士学位论文 前1条

1 许亮;miR-543在胶质瘤中的表达及其生物学功能研究[D];苏州大学;2017年

相关硕士学位论文 前3条

1 王炫;miR-543通过靶向Numb促进前列腺癌细胞增殖、转移和干性特征的研究[D];长江大学;2019年

2 李娟;miR-543通过抑制SIRT1促进胃癌的发生发展[D];山东大学;2016年

3 薛璟;miR-543对肌肉生长发育的调控及其靶基因Wnt7a基因遗传变异的研究[D];西北农林科技大学;2013年

本文编号：2863230