去势抵抗性前列腺癌免疫微环境对肿瘤进展的作用及其机制研究

发布时间：2020-11-08 09:30

　　 研究背景:前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)在世界范围内已经成为男性发病人数第二、死亡人数第五的肿瘤,其严重威胁着中老年男性的生活健康。在美国,前列腺癌是男性发病率第一、死亡率仅次于肺癌的肿瘤。前列腺癌的发病率有着明显的地理差异,在中国,由于人们物质生活水平的提高,饮食结构的改变等等,前列腺癌的发病率虽然远低于欧美发达国家的水平,但增长速度越来越快。1998~2008年,我国前列腺癌发病率年均增加比例约为12.07%,是男性增长率最快的肿瘤。雄激素剥夺治疗(ADT)是目前治疗晚期前列腺癌病人最有效的方法,但是这些病人最终都会不可避免的进展到去势抵抗性前列腺癌(CRPC)阶段。尽管目前有多种治疗方式在尝试解决这个问题,如化疗(多西他赛、卡巴他塞)、放疗、新型研发的雄激素受体(AR)通路抑制剂(恩杂鲁胺、阿比特龙)、Ra-223以及仍处于试验阶段的PARP抑制剂奥拉帕尼等等,无一例外都难以彻底逆转CRPC的进展,因此需要更多的研究去弄清这些治疗药物的耐药机制,或者亟需更多新兴的药物研发以治疗CRPC患者。值得注意的是,目前大部分研究都只关注肿瘤细胞本身,而对其赖以生存的周围环境却研究较少。但我们知道,肿瘤的发生发展离不开其周围的环境。“种子土壤”学说指出,“种子”和它周围的“土壤”共同构成了肿瘤发生发展的因素。因此,对于肿瘤来说,其发生发展及转移的过程都是与其周围环境密不可分的,我们应该将肿瘤及其微环境作为一个整体进行研究,这样也许就能解决目前的困境。肿瘤微环境中包括微血管、成纤维细胞、间质细胞、免疫细胞等,还包括各种细胞分泌的细胞因子、趋化因子、化学因子等,它们共同形成了一个复杂的网络,调控肿瘤细胞的发生发展及转移。而这其中,免疫细胞在肿瘤的进展过程中起了至关重要的作用。针对CTLA4或者PD1/PDL1的抗体已经在包括肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌等多个肿瘤中证实有效。这说明针对肿瘤微环境进行靶向治疗的策略切实可行。但是在前列腺癌中,传统的免疫治疗似乎对这两种免疫检查点抑制剂的效果并不明显。因此就需要我们去寻找耐药机制,并进一步探索新的免疫治疗方法。研究目的:本课题旨在探索晚期前列腺癌耐药机制与周围免疫微环境之间的关系和相互作用机制,主要分为以下三个部分:首先,从恩杂鲁胺耐药的晚期前列腺癌患者出发,探索其周围免疫微环境细胞,即肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)与肿瘤细胞之间的作用关系。其次,探索肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)与肿瘤细胞的具体作用机制。最后,将晚期前列腺癌患者与其周围的免疫微环境作为一个整体进行研究,发现并比较CRPC进展过程中前列腺癌组织微环境中免疫细胞的整体分布情况,绘制免疫图谱。对CRPC组织免疫细胞进行单细胞Bulk测序分析,发现其细胞内的分子水平变化,寻找合适的干预靶点,设计小分子药物和单克隆抗体,探索用于临床治疗的可能。研究方法:本课题前两部分的研究,首先通过免疫组化的方法发现了TAMs与晚期耐药前列腺癌患者的关系,并验证了140例临床患者的基本资料,紧接着通过体外建立共培养细胞系,即单核巨噬细胞系与前列腺癌耐药细胞系之间的共培养体系,研究TAM与前列腺肿瘤细胞之间的作用关系和机制。还通过Western Blot,qPCR,免疫共沉淀IP,染色质免疫共沉淀CHIP等蛋白质和转录组学的方法确定了两者在转录层面和表达层面之间的分子变化。此外,我们用抗体芯片确定了TAMs分泌IL6来影响肿瘤细胞的耐药机制,并用ELISA等实验进行了验证。除此之外,在确定关键的作用机制靶点之后,我们构建了免疫缺陷小鼠前列腺癌耐药模型,在小鼠体内,针对几个关键靶点的药物以及治疗手段进行试验。在第三部分的研究中,我们对早期前列腺癌和晚期前列腺癌组织应用CyTOF技术,发现了其免疫微环境中各种免疫细胞的变化情况,并根据某些功能分子进行分群。针对其主要免疫反应的T细胞,我们将其分离提纯,并进行了Bulk测序,发现了其转录组的详细改变,由此发现了NRP1这个关键的免疫检查点。并找到了它的作用配体,即肿瘤细胞分泌的SEMA3A,并通过一系列针对于T细胞的增殖、分泌实验,在体外水平验证了它能够通过NRP1发挥抑制T细胞免疫反应的作用。研究结果:首先,我们通过免疫组化和体内动物实验的方法发现了,肿瘤周围的TAMs与ADT诱导的前列腺癌神经内分泌分化呈正相关。并且这两者的关系和患者临床资料的预后、生化复发也有统计学上的相关意义。其次,我们通过建立共培养体系,发现了耐药的前列腺癌细胞能够募集并极化TAMs。更有趣的是,募集并极化的TAMs也能够进一步导致前列腺癌细胞的耐药和神经内分泌分化。紧接着,我们通过抗体芯片的方式找到了TAMs是通过分泌IL6/STAT3通路来影响肿瘤细胞的耐药特性的。而具有恩杂鲁胺耐药特性的前列腺癌细胞则是通过扩增和分泌HMGB1来影响TAMs,即HMGB1不仅能够稳定肿瘤细胞内β-catenin不被降解,使其顺利入核激活下游神经内分泌相关基因转录,而且能够分泌入细胞间隙,通过旁分泌的方式作用于单核巨噬细胞,募集并使其极化为TAMs,从而使TAMs又分泌更多的IL6去影响肿瘤细胞,由此形成了一个正反馈环路,导致前列腺癌细胞的耐药性。接下来,我们构建了免疫缺陷小鼠前列腺癌耐药模型,将针对几个关键靶点的药物即针对HMGB1和IL6R的药物,将其应用于小鼠模型中,发现不管是单用任何一种药物,较安慰剂组相比,都能够显著改善其耐药的特性,两者联合使用效果更佳。最后,我们将研究重点扩展到了整个晚期前列腺癌的免疫微环境,通过CyTOF技术发现晚期去势抵抗性前列腺癌CRPC患者的免疫微环境较早期改变显著,绘制了两者的免疫图谱差异,并详细比较了包括CD4T细胞、CD8T细胞、Treg细胞、单核/巨噬细胞、B细胞、NK细胞、MDSC细胞、DC细胞等在内的各种免疫细胞的改变差异,我们发现T细胞在免疫微环境中的改变尤其重要。因此我们将肿瘤组织中的T细胞进行了Bulk测序,找出了T细胞功能改变的关键分子NRP1,并通过一系列体外实验发现了其作用配体SEMA3A,证实SEMA3A是通过作用于T细胞表面的NRP1最终导致T细胞增殖能力降低、分泌功能下降、发挥免疫功能的能力丧失,从而产生免疫逃逸的机制。研究结论:本研究从TAMs与晚期耐药肿瘤细胞的互相作用关系着手,发现了肿瘤周围免疫微环境对肿瘤细胞进展、耐药的影响,并且发现了晚期前列腺癌中,其耐药的细胞系通过HMGB1的自分泌与旁分泌功能募集、趋化单核巨噬细胞,TAMs形成后分泌IL6/STATA3通路反过来促进肿瘤细胞的耐药的环路。除此之外,还将晚期前列腺癌与早期前列腺癌的的整个免疫微环境绘制出了一张清晰的图谱,而且对比分析后发现了其中重要的抑制免疫反应的一条通路,为新的免疫治疗策略奠定了扎实的基础,为晚期耐药前列腺癌患者提供了新的希望。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

志物 NSE 和 CHGA 相比之下也偏高，如图 1-1 C,D 及 1-2C,D 所示。除此之外，我们比较了 CRPC 组织中 CD163 表达量在阴性表达及高表达神经内分泌标志物中的差异，发现在 CRPC 中，CD163 在高表达 NE 标志物的组织里表达量较高，如图 1-1 E,F 及 1-2 E,F 所示。因此，这些数据暗示在前列腺癌中TAMs 与 ADT 诱导的神经内分泌分化有正性相关的关系。

图 1-2 前列腺癌神经内分泌标志物在疾病不同状态的差异统计分析表 1-1 经过 ADT 治疗后转移性去势抵抗性前列腺癌患者的基本资料o. Aget-PSA(ng/ml)Metastatic site SVI PNIPre-GSMedication Post-GSDuratio(months1 70 151 lymph node, bone N Y 4+5=9LeuprorelinAcetate andBicalutamide4+5=9 42 57 76.1 bone N N 5+4=9 3+4=7 63 82 10.6 lymph node N N 5+5=10 5+5=10 144 67 88 lymph node, bone N N 5+4=9 5+4=9 5.55 81 1459 lymph node, bone N N 5+4=9 5+4=9 6除此之外，我们还检测了 CD163 与 NSE 或者 CHGA 的这种共表达关系是否与前列腺癌患者的临床预后有关。如图 1-3 及表 1-2 及表 1-3 所示，共有 140 个患者被分成了四组，我们同时检测了 CD163 与 NSE 或者 CHGA 它们的表达量之间的关系，发现两者的共表达与预 Gleason 评分，肿瘤分期，膜侵袭状态，手

图 1-3 CD163 与 NSE 标志物跟前列腺癌临床特征之间的关系除此之外，我们还在小鼠动物模型中验证了这一结果。如图 1-4 所示，我们将带有荧光基团的 C4-2 细胞系注射进小鼠的前列腺中，第四周后对小鼠进行手术去势，与此同时服用恩杂鲁胺药物，以后每周通过小动物活体成像仪检测肿瘤体积变化以及血浆 PSA 水平。结果发现，最开始 PSA 水平是下降的，而且肿瘤的生长速度也变慢了，但是在晚期，PSA 水平和肿瘤的生长速度都升高了，这说明小鼠原位移植经过长时间 ADT 治疗后，恩杂鲁胺耐药了。而且，我们检测了小鼠组织中 F4/80，NSE 以及 CHGA 的表达量，发现它们都比对照组的表达量升高。这些结果说明，ADT 诱导的神经内分泌分化不仅是前列腺癌 ADT 治疗抗性的原因之一，同时它的发生也和 TAM 的浸润密切相关。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 姚凤球 ,凌斌;母胎界面免疫微环境的研究进展[J];国外医学.妇产科学分册;2005年05期

2 赵潇溟;胡晓霞;王健民;;异基因造血干细胞移植后骨髓免疫微环境重建研究[J];中国免疫学杂志;2016年09期

3 闫凤亭,李大金;母胎界面免疫微环境及其功能[J];国外医学.妇幼保健分册;2000年03期

4 杨文艺;胡镜宙;;干扰素和自噬在肿瘤免疫微环境中的研究进展[J];医学研究生学报;2017年03期

5 柯娇娇;;肿瘤免疫微环境在肿瘤常规治疗效应中的作用[J];现代养生;2018年06期

6 刘洋;陈静;;大肠“传道”功能与免疫微环境的相关性探析[J];时珍国医国药;2018年10期

7 吴有军;杜晓辉;;2a型腺苷受体在促进肿瘤免疫微环境抑制状态形成中的作用[J];肿瘤防治研究;2017年06期

8 王宏;;运动调节机体免疫微环境的研究进展[J];临床输血与检验;2017年03期

9 何浪;宋海星;曾顺泽;彭果;郑广荣;张俊刚;姜青贵;王丹;;乳腺癌外周血单个核细胞与间质免疫微环境的关系研究[J];免疫学杂志;2012年06期

10 王莉;梅铭惠;孙煦化;陈红松;张恒辉;;转录因子Foxp3在肿瘤免疫微环境中的作用[J];山东医药;2010年52期

相关博士学位论文 前10条

1 刘飞;去势抵抗性前列腺癌免疫微环境对肿瘤进展的作用及其机制研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2019年

2 刘乔飞;胰腺癌肿瘤免疫微环境全景与吉西他滨化疗[D];北京协和医学院;2018年

3 张颖异;微卫星不稳定性对结直肠癌肿瘤免疫微环境的影响[D];北京协和医学院;2016年

4 侯嘉杰;受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶在肝细胞肝癌炎症/免疫微环境中的抑癌作用及机制研究[D];南京医科大学;2015年

5 高强;免疫微环境与肝细胞癌复发转移及“免疫微环境分子预测模型”的建立与验证[D];复旦大学;2008年

6 刘含智;肿瘤转移的免疫生物学机制和免疫治疗[D];中国协和医科大学;2008年

7 刘卫仁;免疫微环境及代谢在肝细胞癌侵袭与转移中的作用研究[D];复旦大学;2014年

8 陈龙;SLC-CCR7信号轴在肝癌免疫微环境中的作用机制研究[D];复旦大学;2014年

9 辛冰牧;调节肾组织免疫微环境预防和逆转肾纤维化[D];北京协和医学院;2008年

10 于海明;乳腺癌免疫微环境与预后和治疗的关系研究[D];中国人民解放军医学院;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 郭舜;CNOT7基因敲减通过减少HepG2细胞TGF-β分泌对肿瘤免疫微环境的影响[D];山西医科大学;2019年

2 赵海潮;CNOT7基因敲减通过JAK/STAT通路减少GM-CSF分泌对肝癌肿瘤免疫微环境影响的相关研究[D];山西医科大学;2019年

3 王优优;不同分割模式放疗对小鼠移植瘤免疫微环境的影响及机制研究[D];天津医科大学;2018年

4 李媛媛;FTY720对肿瘤免疫微环境的调节作用及其机制研究[D];河南大学;2015年

5 杨柳晓;肿瘤浸润淋巴细胞与肝癌预后及其与“免疫微环境分子预测模型”的关系[D];复旦大学;2009年

6 段琼;免疫微环境对EGFR-TKI抑制异质肺癌的影响研究[D];第四军医大学;2017年

7 宋晓丹;乌司他丁联合多西他赛对乳腺癌免疫微环境的影响[D];重庆医科大学;2014年

8 姚凤球;妊娠期肝内胆汁淤积症患者母胎界面免疫微环境的研究[D];安徽医科大学;2006年

9 张志强;大鼠肝癌免疫微环境中Treg细胞与TGF-β1、IL-10水平的相关性分析[D];山西医科大学;2014年

10 桑友洲;错配修复缺陷与NSCLC免疫微环境的相关性研究[D];天津医科大学;2016年

本文编号：2874598