研究背景及目的:常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最常见的遗传性肾脏病,其在人群中的发病率约为1:400~1:1000。大多数患者于青年时期发病,主要病理改变为肾小管进行性囊性扩张,压迫正常的肾脏结构,破坏肾脏功能,最终导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)。约50%的ADPKD患者在60岁时进展至ESRD,只能依赖透析或者肾移植维持生命,给社会和家庭带来了沉重的负担。目前已经明确ADPKD的致病基因为突变的Pkd1和Pkd2基因(分别编码多囊蛋白1和多囊蛋白2),其中,Pkd1基因突变占85%。尽管ADPKD的主要致病基因已经明确,然而由于Pkd1基因编码序列过长,突变位点及突变方式变化多端,使得其临床表现在不同遗传家系之间存在巨大差异;然而随着研究的深入,我们发现,尽管在同一个遗传家系之内,乃至同卵双胞胎之间,该疾病的进展与预后仍存在着很大差异,这提示我们,除了基因本身的突变之外,基因的转录及转录后调控等表观遗传学过程也会对该疾病的进程起到很大的影响作用。而基因的甲基化是一种非常重要的基因转录调控机制。因此,我们课题组对多囊肾病患者的肾脏标本进行了甲基化测序,发现Klotho蛋白启动子区域存在基因甲基化水平升高,提示该蛋白在多囊肾病的发病进程中可能存在表达下调。Klotho蛋白(也作α-Klotho蛋白)是一种主要表达于远端肾小管及大脑的Ⅰ型膜蛋白,由KL基因编码。该蛋白由KL1和KL2两个亚基组成,可以被去整合素和金属蛋白酶(A desintegrin and metalloproteinase,ADAM)10和ADAM17切割为不同长度的片段并释放进入血液、尿液及脑脊液中,成为一种内分泌、自分泌和旁分泌因子,同多种受体结合,作用于其他细胞,其中起到最主要作用的是可溶性全长Klotho蛋白。1997年,Kuro-o等人发现,Klotho基因5’端插入突变的小鼠会出现多种衰老相关体征,且寿命明显缩短。研究发现,Klotho蛋白不仅调控衰老过程,还参与多种疾病的发生和发展,如肿瘤、二型糖尿病、心肌肥厚和慢性肾衰竭。目前已有相关临床研究证实,ADPKD患者血清中Klotho蛋白水平降低,且与肾脏总体积负相关。除此之外,Klotho蛋白作为一种具有抑制炎性反应作用的因子,能够调控TGF-β、Akt、Wnt和TNF-α等相关信号通路,而这些通路在常染色体多囊肾病的发病进程中均起到重要作用,因此探究Klotho蛋白在常染色体显性多囊肾病囊肿发生及生长的过程中起到的作用具有重要意义。本研究拟探究Klotho蛋白在多囊肾病细胞系及组织中的表达情况,明确Pkd1突变对Klotho蛋白表达的影响,以及Klotho蛋白在ADPKD囊肿发生发展过程中的作用及机制,为疾病的治疗提供新的作用靶点。研究方法:(1)收集临床ADPKD患者肾脏组织样本及正常肾脏组织样本,Pkd1条件敲除小鼠肾脏组织样本及野生型小鼠肾脏样本,Pkd1~(+/-)和Pkd~(-/-)肾脏上皮细胞系,利用蛋白免疫印迹、免疫组织化学和RT-PCR技术,检测其中Klotho蛋白的表达情况。(2)建立晚期诱导PKD1~(fl/fl):tamoxifen-cre小鼠模型,模拟ADPKD发病真实情况,进一步观察鼠重组Klotho蛋白对囊肿生成的调控作用。(3)通过蛋白免疫印迹检测c-Myc,Cyclin D1,p-STAT3等蛋白水平,验证Klotho对小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞增殖的调控作用。(4)通过对ADPKD患者肾脏组织及正常肾脏组织的基因甲基化测序,明确Klotho在ADPKD中表达下调的原因,并通过染色质免疫共沉淀技术,验证DNMT1蛋白与Klotho启动子区域结合情况;通过蛋白免疫印迹技术检测DNMT1蛋白与Klotho蛋白的调控环路。(5)通过蛋白免疫印迹技术及RT-PCR技术,分别检测Smyd2、p-P65、TNF-α、Ccl-2的表达水平,明确Klotho对小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞炎性反应的调控作用。(6)通过细胞流式技术检测C11:BODIPY581/591在小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞染色的阳性率,蛋白免疫印迹技术及RT-PCR技术检测GPX-4在小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞及小鼠肾脏中的表达情况,并进行细胞MTT实验,明确Klotho对铁死亡过程的影响作用;(7)通过小鼠肾脏组织Masson染色、α-SMA染色、Collagen-Ⅰ染色,以及小鼠肾脏组织蛋白免疫印迹技术检测TGF-β、Fibronectin、α-SMA、p-smad2/3蛋白水平,明确Klotho对ADPKD中的纤维化过程的抑制作用;在大鼠成纤维细胞中验证TGF-β对Klotho表达的抑制作用。结果:(1)Klotho蛋白在ADPKD患者肾脏组织、小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮及PKD1~(fl/fl):Pkhd1-cre小鼠肾脏组织中表达下调。(2)在晚期诱导PKD1~(fl/fl):tamoxifen-cre小鼠模型中,腹腔注射鼠重组Klotho蛋白能够延缓ADPKD病情进展,改善肾功能,减缓肾脏体积增长速度。(3)鼠重组Klotho蛋白能够下调小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞增殖相关通路蛋白水平,抑制细胞增殖。(4)ADPKD患者肾脏组织基因甲基化测序提示,Klotho基因在ADPKD肾脏中,启动子及基因体区域高度甲基化。甲基化特别是启动序列的甲基化会使基因沉默,表达下调。(5)染色质免疫共沉淀技术在小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞中发现,Klotho基因启动子区域与DNMT1存在结合。(6)DNMT1抑制剂Hydralazin处理小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞能够上调Klotho蛋白表达水平;同时,鼠重组Klotho蛋白能够下调小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞及ADPKD小鼠肾脏组织中的DNMT1水平。(7)鼠重组Klotho蛋白能够下调Smyd2及p-P65蛋白水平,抑制TNF-α和Ccl-2表达,从而抑制细胞及小鼠ADPKD肾脏组织的炎性反应。(8)鼠重组Klotho蛋白处理小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞后,以MTT检测细胞活性,发现尽管Klotho蛋白能够抑制多条细胞增殖相关通路,然而Klotho处理组存活细胞数量较对照组并无下降,甚至还有轻微升高趋势,提示Klotho处理可能抑制某种细胞死亡过程。(9)鼠重组Klotho蛋白能够上调小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞及小鼠ADPKD肾脏组织中GPX-4的表达水平,抑制铁死亡发生。(10)流式细胞学检测发现,鼠重组Klotho蛋白处理小鼠PKD1~(-/-)肾小管上皮细胞后,C11:BODIPY581/591染色阳性细胞比例下降,提示Klotho能够减轻细胞的脂质过氧化情况,从而抑制铁死亡发生。(11)Masson染色、α-SMA染色及Collagen-Ⅰ染色提示,外源性补充Klotho蛋白能够抑制ADPKD中的纤维化进程;同时,Klotho处理能够下调ADPKD小鼠肾脏组织中的纤维化相关蛋白表达水平,进一步证实其对纤维化进程的抑制作用。(12)TGF-β处理大鼠成纤维细胞能够抑制Klotho蛋白表达。结论:(1)Klotho蛋白在ADPKD囊肿发生发展中起到重要的调控作用;(2)DNMT1引起的Klotho基因启动子区域甲基化水平升高,是导致Klotho蛋白在ADPKD中表达下调的主要原因;(3)Klotho蛋白能够通过影响ADPKD发病过程中细胞的增殖、死亡、炎性反应及纤维化进程等方面,调控ADPKD病情进展。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692
【部分图文】：
p<0.001。实验结果Klotho 蛋白在 Pkd1 敲除肾脏上皮细胞系中的白在正常的肾小管上皮中表达，为了初步验证在 Pkd1 缺，我们选取了两组 Pkd1 突变肾脏上皮细胞系，分别代表d1 突变的病理生理情况，并通过 RT-PCR 验证 Klotho 基因，以及蛋白免疫印迹验证 Klotho 蛋白的表达情况。lotho 蛋白在小鼠 Pkd1-/-和 Pkd1+/-肾小管上皮细胞验通过 RT-PCR（图 1-1A）验证了相较 Pkd1+/-肾小管上皮胞系的 Klotho 基因在转录水平上明显下调（t 检验，1.001 ±0.03802%，P=0.0016，t=7.668）；而后又通过蛋白免疫Klotho 蛋白水平在 Pkd1 突变的肾小管上皮中明显下降（图环境下，Pkd1 基因突变对 Klotho 蛋白表达的影响。
. Klotho 蛋白在小鼠胚肾 Pkd1 WT 和 Pkd1 null MEK 细胞系）Klotho 蛋白在 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre 小鼠中的表kd1fl/fl：Pkhd-cre小鼠的繁育及基因鉴定型为 Pkd1fl/+：Pkhd-cre（+）的适应公鼠和母鼠合笼，待母鼠产鼠的出生日期，在小鼠出生第五天进行剪脚趾编号，并将剪下基因鉴定，见图 1-3。其中，基因型为 F4R5(-/-)Cre(+)为 PKre（-）及 F4R5（+/+）Cre（+）的小鼠可作为野生型对照。
图 1-2. Klotho 蛋白在小鼠胚肾 Pkd1 WT 和 Pkd1 null MEK 细胞系的表达（二）Klotho 蛋白在 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre 小鼠中的表达1、 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre小鼠的繁育及基因鉴定将基因型为 Pkd1fl/+：Pkhd-cre（+）的适应公鼠和母鼠合笼，待母鼠产下小鼠后，确记录小鼠的出生日期，在小鼠出生第五天进行剪脚趾编号，并将剪下的脚趾及鼠组织进行基因鉴定，见图 1-3。其中，基因型为 F4R5(-/-)Cre(+)为 PKD 发病小鼠，因型为 Cre（-）及 F4R5（+/+）Cre（+）的小鼠可作为野生型对照。
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