晚期糖基化终产物通过RAGE/ROS通路影响肾小管上皮细胞自噬-溶酶体系统

发布时间：2020-12-05 07:01

　　目的本研究探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对肾小管上皮细胞（TECs）自噬-溶酶体系统的影响,及其是否通过与RAGE受体的相互作用引发氧化应激而造成溶酶体损伤,为糖尿病肾病的治疗提供新思路。方法AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2细胞12h后,加用或不加用溶酶体抑制剂用蛋白免疫印迹和免疫荧光检测LC3-II转化,研究AGEs对肾小管上皮细胞自噬活性的影响;运用免疫荧光共标记观察LAMP1和LC3-II共定位,检测AGEs对肾小管上皮细胞自噬泡与溶酶体融合的影响。AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2细胞6、12、24h后,运用组织蛋白酶B（CB）、D、L试剂盒分别检测AGEs对HK-2细胞溶酶体组织蛋白酶的活性;免疫荧光和流式细胞术观察示踪红（TLR）荧光和DQ-卵清蛋白荧光,检测AGEs对肾小管上皮细胞溶酶体酸化程度和溶酶体消化功能的影响;运用免疫荧光共标记观察LAMP1和CB荧光,检测AGEs对肾小管上皮细胞溶酶体完整性（溶酶体膜通透化LMP）的影响。AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2细胞,免疫荧光和流式细胞术观察阻断AGEs与抗体结合或抗氧化剂预处理... 

【文章来源】：暨南大学广东省 211工程院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

自噬通路动态流程示意图（摘自：JohansenT,etal.Autophagy,2011;7(3):279-96.）

酶和溶酶体膜的共定位情况来评价溶酶体膜通透。未受刺激的HK-2细胞（0h）在显示出规则的绕核分布的颗粒状CB的红色荧光，但是AGE-BSA分别刺激6h，12h，24h后，CB的光点变得分散而不规则，提示CB从溶酶体中漏出到了胞浆(图3.3A,B)。进一步来看CB从溶酶体中的漏出和溶酶体膜通透的关系，免疫荧光双标记溶酶体膜蛋白LAMP-1及溶酶体酶CB，对照组肾小管上皮细胞内LAMP1光点规则绕核分布于胞浆中，而且大部分与CB荧光共定位。AGE-BSA刺激后溶酶体膜蛋白LAMP1在细胞内分布不规则，聚集呈粗大成团状分布，组织蛋白酶CB和LAMP1没有明显的共定位，CB散布于LAMP1外，不管是用LAMP1变化还是CB变化所提示的发生LMP的细胞占总的HK-2细胞的百分比随着AGE-BSA作用时间的延长而增加，与对照组相比，差异有统计学意义，P < 0.01（图3.3A, B

45图 4.1 抗 RAGE 抗体或抗氧化剂预处理对 AGE-BSA 刺激后 HK-2 细胞溶酶体酸化程度的影响(A) 荧光显微镜观察经过抗 RAGE 抗体、NAC 或 catalase (CAT)预处理后，暴露于 Co-BSA或 AGE-BSA 的 HK-2 细胞示踪红荧光； (B)流式细胞术检测示踪红荧光信号和平均荧光强度，细胞分组处理同（A） 注：比例尺，20 μm. *P < 0.05，**P < 0.01.


本文编号：2899077