Parkin介导CD36单泛素化在高脂诱导肾小球足细胞凋亡中的作用

发布时间：2017-04-08 20:36

  本文关键词：Parkin介导CD36单泛素化在高脂诱导肾小球足细胞凋亡中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：随着人们生活水平的提高,糖尿病发病率逐年增高,而作为糖尿病主要死亡原因之一的糖尿病肾病也逐渐威胁着人们的健康,成为一个全球性健康问题。糖尿病的并发症主要分为大血管和微血管病变,而作为微血管病变之一的糖尿病肾病,是糖尿病人致死的主要原因,临床特征性病变为蛋白尿,逐渐发生肾脏功能的损害,最终导致肾功能衰竭。高血糖是糖尿病肾病主要发病机制之一,它可改变细胞内外代谢：如糖基化终末产物、蛋白激酶C活性的增加和多元醇代谢异常,还可引起细胞内的应激缺氧、氧化应激和内质网(ER)应激,最终出现糖尿病肾脏损害。此外,糖尿病肾病患者还常常伴有高脂血症,而高脂血症既可加重肾病患者已有的肾损害,又会导致健康的肾脏受损,脂代谢紊乱与高糖协同作用,最终导致糖尿病肾病的发生。足细胞(Podocyte)是肾小球固有的细胞之一,与内皮细胞、基底膜(GBM)一起共同构成肾小球滤过屏障,是阻止血浆蛋白丢失而形成蛋白尿的最后屏障。早期研究表明,多种损伤因素如针对细胞膜抗原的抗原抗体反应,血流动力学改变,代谢因素,基因突变,中毒,感染,蛋白超负荷等都能直接或间接影响到足细胞。足细胞损伤形式多种多样,包括：1)足突融合消失,2)足细胞裂孔膜成分表达和分布异常,3)足细胞活化分泌炎症介质、分泌细胞外基质,4)足突与肾小球基底膜粘附功能损伤,5)足细胞凋亡、脱落,6)足细胞数量密度减少。在2型糖尿病患者中,足细胞数量的减少,预示着肾脏功能的进行性恶化及蛋白尿的进行性加重。而足细胞的凋亡便是足细胞数量减少的一个主要机制。CD36是一种跨膜糖蛋白,属于B族清道夫受体,在体内多种细胞表达,如巨噬细胞,脂肪细胞,微血管内皮细胞,肾小管上皮细胞,足细胞等。CD36可与多种配体相结合,包括长链脂肪酸(long chain fatty acid, LCFA)和修饰的低密度脂蛋白(OxLDL),糖基化终末产物(AGEs),血小板反应蛋白(TSP-1),以及胶原蛋白Ⅰ和Ⅳ,从而参与各种生理病理过程。有研究显示,CD36可介导细胞摄取脂质增加,进而参与多种疾病的发生,比如：在巨噬细胞中,CD36介导ox-LDL或脂肪酸的吸收,从而导致粥样硬化病变；在肝细胞中,CD36参与肝脏损害及肝纤维化的发生；在近端肾小管上皮细胞中,CD36介导近端肾小管上皮细胞的凋亡而导致糖尿病肾病的发生发展。但是,关于CD36在糖尿病肾病中高脂介导的足细胞凋亡中的作用却少有报道。parkin基因是常染色体隐性遗传性少年型帕金森综合征(AR-JP)的致病基因,位于6号染色体上,由465个氨基酸组成,其氨基端有76个氨基酸与泛素同源,称为泛素样结构域(UBL),羧基端称为RING-box区域(RBR),包括212个氨基酸,由两个环指结构(RING1，RING2)以及它们之间的环指间区(IBR)组成,泛素样结构域和环指结构域之间的区域称为连接区(the linker region)。 Parkin蛋白可作为E3泛素蛋白连接酶,与E1泛素蛋白激活酶和E2泛素蛋白结合酶一起可促使一种或几种未知底物蛋白的泛素化(包括多聚泛素化和单泛素化)。研究发现,Parkin可介导B族清道夫受体CD36的单泛素化,而增加其蛋白的稳定性,进而导致细胞对脂肪酸吸收增加。但是关于parkin介导的CD36单泛素化修饰过程在脂肪酸介导的肾小球足细胞凋亡中的作用,目前未见报道。本研究通过棕榈酸刺激足细胞模拟体内高脂环境,观察Parkin与CD36的mRNA及蛋白水平的表达,细胞内脂质沉积,以及进一步出现的脂毒性引起的足细胞凋亡。通过实验现象研究并探讨其可能的机制,为临床上进一步认识高脂血症肾损害机制及其干预治疗提供一定的理论依据。目的：研究parkin调节CD36降解在脂肪酸介导的肾小球足细胞凋亡中的作用。方法：收集石蜡包埋的DN肾活检组织切片标本,同时以因外伤手术切除的肾组织(无基础肾脏疾病及不伴高脂血症患者肾脏组织)作为对照组,采用免疫组化及免疫荧光染色来检测肾脏组织中Parkin及CD36的表达情况。体外培养小鼠永生性肾小球足细胞株(MPC5),用棕榈酸钠(一种饱和脂肪酸)刺激足细胞,采用Q-PCR, western blot及细胞免疫荧光来检测Parkin及CD36在足细胞中的表达；油红染色及BODIPY荧光探针检测细胞内脂质集聚水平的变化；流式细胞仪、TUNEL染色及western blot检测足细胞凋亡；DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平。数据结果以均数±标准差(x±s)表示,数据用SPSS 21.0软件处理,两组资料比较采用t检验,多组资料比较采用单因素方差分析,P值0.05为差异有统计学意义。结果：(1)免疫组化及组织免疫荧光显示,Parkin及CD36在伴高脂的糖尿病肾病患者肾脏组织肾小球及肾小管中的表达较对照组明显增高,且二者在肾脏组织中存在共定位。(2)采用Q-PCR, western blot及细胞免疫荧光显示棕榈酸钠刺激后,足细胞Parkin及CD36 mRNA及蛋白表达水平明显上调,各组两两比较,差异有显著性(P0.05)。免疫荧光显示足细胞中Parkin及CD36存在共定位。(3)我们通过油红O及BODIPY染色来检测足细胞内脂质摄取,结果显示,棕榈酸钠刺激下,足细胞内脂质摄取明显增加,而用CD36特异性抑制剂SSO预处理后,发现SSO抑制了棕榈酸钠所致的脂质摄取的增加。(4)流式细胞术结果显示在一定浓度范围内,棕榈酸钠呈剂量依赖性的诱导足细胞凋亡；TUNEL及PI染色也进一步证实,棕榈酸钠诱导组较对照组的调亡细胞大量增加；采用western blot检测发现,棕榈酸钠刺激下足细胞cleaved-caspase3呈剂量依赖性地表达增加。(5)实验中,我们用CD36特异性抑制剂SSO预处理足细胞,结果发现SSO可抑制棕榈酸钠诱导足细胞的凋亡,与对照组、棕榈酸组各组两两比较,差异有显著性(P0.05)。 (6)DCFH-DA(2',7'-dichlorof luorescein diacetate)染色发现,在棕榈酸钠刺激下,足细胞内ROS的产生明显增加,而用CD36的特异性抑制剂SSO预处理后,ROS的产生明显减少。同时,氧自由基清除剂tempo1也能减少棕榈酸钠刺激引起的氧自由基增加及凋亡增加。(6)我们采用免疫荧光及免疫共沉淀实验技术,研究发现足细胞内Parkin与CD36蛋白相互结合,足细胞过表达Parkin后,CD36降解减少,提示足细胞中Parkin可能单泛素化CD36,抑制其降解。结论：Parkin与CD36参与高脂介导的足细胞凋亡,这可能是脂代谢紊乱肾损害的重要机制之一。
【关键词】：Parkin CD36 足细胞 凋亡 棕榈酸钠
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.9;R587.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-19
• 1. 材料、试剂和仪器19-24
• 2. 实验方法24-30
• 3. 结果30-40
• 4. 讨论40-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-48
• 文献综述48-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 攻读硕士学位期间发表的论文59

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本文编号：293645