α-parvin在维持足细胞结构和功能稳态中的作用研究
发布时间：2021-01-28 00:15
肾小球疾病是威胁全球人类健康的公共卫生问题,给家庭及社会带来巨大的经济压力,是当今研究的前沿热点和重点方向。足细胞结构和功能的损伤是多种肾小球疾病发生的中心环节。但至今人们对多种肾小球疾病尤其是足细胞结构损伤的发病机制、研究防治及相关干预的措施仍缺乏准确系统的了解,针对肾小球疾病的治疗手段尚为稀少。因此,深入研究足细胞损伤的分子机制,明确诱导足细胞损伤的信号通路,将为肾小球疾病的防治提供新的思路和科学依据。α-parvin是一种极其重要的黏着斑蛋白,通过连接整合素和肌动蛋白骨架参与细胞骨架定位,调节细胞与细胞外基质粘附的信号转导,从而在细胞粘附、伸展、存活等方面起着重要作用。然而,目前关于α-parvin在维持足细胞正常结构和功能中的作用仍无任何相关报道。为了探究α-parvin在足细胞中的作用,本研究运用Cre-Lox P重组酶系统成功构建足细胞特异性敲除α-parvin小鼠（α-parvin Neph2c KO）。研究发现足细胞特异性敲除α-parvin会造成小鼠足细胞损伤（足细胞凋亡、裂孔隔膜蛋白组织异常）,进而导致肾小球衰竭（肾小管膨胀、糖原沉积、肾小球和肾间质纤维化）,最终导...
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
肾脏结构示意图[20]
哈尔滨工业大学工程硕士学位论文-7-结构不清，瘢痕形成。临床上常见，多脏器功能损伤与衰竭表现；应及时有效地行透析来缓解中毒症状和严重尿毒症并发症的处理，提高生活与生存质量，延长生命。1.5α-parvin的生理结构α-parvin蛋白是黏着斑蛋白Parvin蛋白家族中的一员。大约2000年时，NikolopoulosandTuner在实验室中从大鼠全DNA中分离和克隆出一个全新的F-actin和PaxillinLD1残基结合蛋白，将其命名为Actopaxin[30]。Tu等人在利用酵母双杂交筛选ILK的结合伙伴时，鉴定并克隆了一种新的含有两个钙结合蛋白同源结构域（Calpainhomologousdomain，CH1、CH2）的ILK结合蛋白，并由此命名为含有ILK结合蛋白的钙同源结构域或CH-ILKBP（CalponinHomologydomain-containingILKBindingProtein）[31]。基于与α-actin结合区的序列同源性，Olski等鉴定并克隆了3种结构相关蛋白，分别命名为α、β和γ-parvin[32]。α-parvin在N端含有两个钙调节蛋白同源结构域（CH1、CH2）和核定位序列（NLS），是一种由N端多肽和2个钙结合蛋白同源结构域（Calpainhomologousdomain、CH1、CH2）串联而成的衔接蛋白。这种结构域使a-parvin能够将丝状肌动蛋白（F-actin）募集到其定位位点并与应力纤维结合。同时结合包括整合素连接激酶（Integrinlinkedkinase，ILK）和Paxilin在内的多种伴侣分子。并通过C端与ILK、PINCH形成PIP复合物，被招募到整合素富集黏附位点，与β-integrins的尾部结合，耦联到细胞骨架激动蛋白上，接受胞外信号，调控细胞骨架的稳态，激活信号通路，调控细胞的行为及形态发生过程，如图1-2所示。图1-2α-parvin蛋白的结构示意图[33]α-parvin蛋白由N端多肽和两个钙调节蛋白同源结构域（CH1、CH2）串联而成，主要通过
哈尔滨工业大学工程硕士学位论文-31-图3-1成功构建足细胞特异性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）a)α-parvinNeph2cKO小鼠模型的构建策略。表达Neph2-Cre的小鼠与α-parvin2、3号外显子两侧携带LoxP位点的小鼠杂交。b）鼠尾全基因组DNAPCR分析。α-parvin-/-基因条带大小为502bp，而α-parvinflox/flox的条带大小为636bp。Cre基因条带大小为412bp。c）α-parvinNeph2cKO小鼠和同窝WT小鼠离体足细胞α-parvin蛋白免疫印迹分析。d）对α-parvinNeph2cKO小鼠和同窝WT小鼠进行肾切片α-parvin蛋白和Nephrin蛋白免疫双荧光染色。标尺10μm。上面版中白框所选定区域的放大图如下面版的图像表示。图b-d代表3个独立的实验。E=Exon；fl=flox；WT=wild-type。3.3本章小结由于全身性敲除α-parvin会导致小鼠胚胎致死，因而我们选定足细胞特异性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）来探究α-parvin在肾小球足细胞中的作用。利用Cre-LoxP重组酶系统（Neph2-Cre）锚定α-parvin基因2、3号外显子得到α-parvinNeph2cKO小鼠。经过鼠尾基因组DNAPCR分析实验验证所有小鼠的出生均遵循孟德尔遗传定律且LoxP序列及Cre序列均插入正确。之后我们提取了原代足细胞进行了蛋白免疫印迹实验验证了小鼠肾脏足细胞中α-parvin蛋白的敲除，除此以外我们利用免疫荧光标签染色证实α-parvinNeph2cKO小鼠足细胞中α-parvin蛋白的敲除，上述结果综合表明我们成功构建了足细胞特异性敲除α-parvin小鼠。
本文编号：3003997
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
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【学位级别】：硕士
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肾脏结构示意图[20]
哈尔滨工业大学工程硕士学位论文-7-结构不清，瘢痕形成。临床上常见，多脏器功能损伤与衰竭表现；应及时有效地行透析来缓解中毒症状和严重尿毒症并发症的处理，提高生活与生存质量，延长生命。1.5α-parvin的生理结构α-parvin蛋白是黏着斑蛋白Parvin蛋白家族中的一员。大约2000年时，NikolopoulosandTuner在实验室中从大鼠全DNA中分离和克隆出一个全新的F-actin和PaxillinLD1残基结合蛋白，将其命名为Actopaxin[30]。Tu等人在利用酵母双杂交筛选ILK的结合伙伴时，鉴定并克隆了一种新的含有两个钙结合蛋白同源结构域（Calpainhomologousdomain，CH1、CH2）的ILK结合蛋白，并由此命名为含有ILK结合蛋白的钙同源结构域或CH-ILKBP（CalponinHomologydomain-containingILKBindingProtein）[31]。基于与α-actin结合区的序列同源性，Olski等鉴定并克隆了3种结构相关蛋白，分别命名为α、β和γ-parvin[32]。α-parvin在N端含有两个钙调节蛋白同源结构域（CH1、CH2）和核定位序列（NLS），是一种由N端多肽和2个钙结合蛋白同源结构域（Calpainhomologousdomain、CH1、CH2）串联而成的衔接蛋白。这种结构域使a-parvin能够将丝状肌动蛋白（F-actin）募集到其定位位点并与应力纤维结合。同时结合包括整合素连接激酶（Integrinlinkedkinase，ILK）和Paxilin在内的多种伴侣分子。并通过C端与ILK、PINCH形成PIP复合物，被招募到整合素富集黏附位点，与β-integrins的尾部结合，耦联到细胞骨架激动蛋白上，接受胞外信号，调控细胞骨架的稳态，激活信号通路，调控细胞的行为及形态发生过程，如图1-2所示。图1-2α-parvin蛋白的结构示意图[33]α-parvin蛋白由N端多肽和两个钙调节蛋白同源结构域（CH1、CH2）串联而成，主要通过
哈尔滨工业大学工程硕士学位论文-31-图3-1成功构建足细胞特异性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）a)α-parvinNeph2cKO小鼠模型的构建策略。表达Neph2-Cre的小鼠与α-parvin2、3号外显子两侧携带LoxP位点的小鼠杂交。b）鼠尾全基因组DNAPCR分析。α-parvin-/-基因条带大小为502bp，而α-parvinflox/flox的条带大小为636bp。Cre基因条带大小为412bp。c）α-parvinNeph2cKO小鼠和同窝WT小鼠离体足细胞α-parvin蛋白免疫印迹分析。d）对α-parvinNeph2cKO小鼠和同窝WT小鼠进行肾切片α-parvin蛋白和Nephrin蛋白免疫双荧光染色。标尺10μm。上面版中白框所选定区域的放大图如下面版的图像表示。图b-d代表3个独立的实验。E=Exon；fl=flox；WT=wild-type。3.3本章小结由于全身性敲除α-parvin会导致小鼠胚胎致死，因而我们选定足细胞特异性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）来探究α-parvin在肾小球足细胞中的作用。利用Cre-LoxP重组酶系统（Neph2-Cre）锚定α-parvin基因2、3号外显子得到α-parvinNeph2cKO小鼠。经过鼠尾基因组DNAPCR分析实验验证所有小鼠的出生均遵循孟德尔遗传定律且LoxP序列及Cre序列均插入正确。之后我们提取了原代足细胞进行了蛋白免疫印迹实验验证了小鼠肾脏足细胞中α-parvin蛋白的敲除，除此以外我们利用免疫荧光标签染色证实α-parvinNeph2cKO小鼠足细胞中α-parvin蛋白的敲除，上述结果综合表明我们成功构建了足细胞特异性敲除α-parvin小鼠。
本文编号：3003997
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