miR-381和miR-424在肾细胞癌中功能的初步研究

发布时间：2021-02-06 05:42

　　肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一。目前其发病率和死亡率都逐年升高。晚期肾癌治疗手段有限、疗效欠佳,主要的原因是其对放化疗、免疫内分泌治疗等辅助治疗均不十分敏感,靶向治疗也仅在少数患者有部分作用。目前中晚期肾癌占大多数,且术后常发生肾癌的复发和转移,因此研究肾癌发生、发展的机制,同时寻求有效地抑制肾癌、改善其化疗耐药的现状有十分重要的意义。microRNA （miR）是近些年来的研究热点,它是一种非编码的小分子单链RNA。不具备开放阅读框架,并不真正有效地表达蛋白,但它可以有效地调节目的基因表达。其主要的方法是通过其种子区与特异性靶向基因的mRNA的3’UTR相结合,诱导靶基因mRNA水平下调或使其翻译抑制,进而调控目的基因表达。目前越来越多的研究表明miR表达的异常是许多肿瘤共同的特征,它在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。miR-381和miR-424也不例外,尽管目前对miR-381和miR-424研究相比较少,但它们对多种肿瘤的影响很明确。miR在肾癌中的功能研究取得了一些进展,但肾癌中miR表达、功能及调节是相当复杂的,目前miR-381和miR-424在肾癌中研究尚未见报道。我... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：142 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
符号说明
前言
第一章 MIR-381和MIR-424在肾癌中表达特点及其靶基因分析
    1. 材料与设备
        1.1 细胞
        1.2 主要试剂
        1.3 主要设备和耗材
    2. 方法
        2.1 生物信息学分析
        2.2 细胞培养
        2.3 细胞的冻存与复苏
        2.4 MIR-381和MIR-424模拟物（MIMIC）的瞬时转染
            2.4.1 miR-381和miR-424 mimic的制备
            2.4.2 细胞准备
            2.4.3 瞬时转染模型物和对照核苷酸
        2.5 REAL TIME PCR
            2.5.1 细胞总RNA提取
            2.5.2 提取细胞小RNA（使用miR提取试剂盒）
            2.5.3 RNA浓度检测
            2.5.4 RNA逆转录为CDNA
            2.5.5 Real time PCR检测
        2.6 WESTERN BLOT实验
            2.6.1 细胞总蛋白的提取
            2.6.2 样本蛋白含量检测
            2.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳
            2.6.4 转膜
            2.6.5 封闭、抗体孵育和显色
            2.6.6 凝胶图像分析系统分析结果
        2.7 双荧光素酶报告基因分析
            2.7.1 实验分组：本实验分为如下各组分别转染：实验对照组、无义序列组（miR-NC）、转染miR-381组和miR-424组
            2.7.2 WEE1（野生型）荧光素酶报告基因载体的构建
            2.7.3 WEE1突变体荧光素酶报告基因载体的构建
            2.7.4 双荧光素酶报告系统检测miR-381和miR-424对靶基因WEE1的直接调控作用
    3. 结果
        3.1 MIR-381和MIR-424靶基因的生物信息学分析
        3.2 MIR-381和MIR-424与靶基因的RNA二级结构分析
        3.3 MIR瞬时转染效率测定
        3.4 MIR-381和MIR-424及其靶基因WEE1的表达
        3.5 肾癌细胞株中WEE1蛋白的表达及其与MIR-381和MIR-424表达水平的相关分析
        3.6 荧光素酶报告基因活性检测分析MIR-381和MIR-424与WEE1靶向关系
    4 讨论
    5 小结
第二章 MIR-381和MIR-424对肾癌细胞株细胞生物学功能影响及其机制研究
    1 材料
        1.1 细胞株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要设备
    2 方法
        2.1 细胞培养
        2.2 细胞的冻存与复苏
        2.3 MIR-381和MIR-424模拟物（MIMIC）的瞬时转染
            2.3.1 miR-381和miR-424 mimic的制备
            2.3.2 细胞准备
            2.3.3 瞬时转染模型物和对照核苷酸
        2.4 MIR-381和MIR-424对786-0、ACHN和HK-2细胞的MTT抑制实验
        2.5 细胞周期的检测
        2.6 细胞凋亡分析
        2.7 荧光酶标仪检测CASPASE3/7酶的活性
        2.8 WESTERN BLOT实验
            2.8.1 细胞总蛋白的提取
            2.8.2 样本蛋白含量检测
            2.8.3 SDS-PAGE凝胶电泳
            2.8.4 转膜
            2.8.5 封闭、抗体孵育和显色
            2.8.6 凝胶图像分析系统分析结果
    3 结果
        3.1 MTT法检测在不同时间点转染MIR-381组和MIR-424对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的生存率的影响
        3.2 CASPASE-3/7活性检测分析在不同时间点转染MIR-381和MIR-424对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的CASPASE-3/7活性的影响
        3.3 细胞凋亡检测分析MIR-381和MIR-424对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的细胞凋亡的影响
        3.4 MIR-381和MIR-424对肾癌细胞786-0细胞周期的影响
        3.5 MIR-381和MIR-424对肾癌细胞影响的机制分析
            3.5.1 过表达miR-381和miR-424可抑制靶基因WEE1表达并促进有丝分裂
            3.5.2 过表达miR-381和miR-424可抑制细胞周期“分子开关”Cdc2磷酸化
            3.5.3 过表达miR-381和miR-424可调控细胞凋亡
            3.5.4 过表达miR-381和miR-424抑制Cdc2磷酸化不依赖于MYT1和Cdc25途径
    4 讨论
    5 小结
第三章 MIR-381增强5-FU在肾癌细胞株中化疗敏感性及其机制研究
    1 材料
        1.1 细胞株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要设备
    2 方法
        2.1 细胞培养
        2.2 细胞的冻存与复苏
        2.3 MIR-381模拟物（MIMIC）的瞬时转染
            2.3.1 miR-381 mimic的制备
            2.3.2 细胞准备
            2.3.3 瞬时转染miR-381 mimics和对照核苷酸
        2.4 MIR-381和5-FU对786-0、ACHN和HK-2细胞的MTT抑制实验
            2.4.1 操作步骤
        2.5 WEE1 SIRNA转染和回复实验
        2.6 细胞周期的检测
        2.7 流式细胞仪细胞凋亡分析
        2.8 荧光酶标仪检测CASPASE3/7酶的活性
        2.9 WESTERN BLOT实验
            2.9.1 细胞总蛋白的提取
            2.9.2 样本蛋白含量检测
            2.9.3 SDS-PAGE凝胶电泳
            2.9.4 转膜
            2.9.5 封闭、抗体孵育和显色
            2.9.6 凝胶图像分析系统分析结果
    3 结果
        3.1 MTT法检测在不同时间点转染MIR-381对不同的5-FU浓度作用下的肾癌细胞及肾小管上皮细胞的生存率的影响
            3.1.1 转染miR-381对不同的5-FU浓度作用下上述细胞的的生存率影响
            3.1.2 联合应用5-FU和转染miR-381在不同时间点上述细胞的的生存率影响
            3.1.3 转染miR-381明显下调786-0细胞5-FU的IC50（半抑制浓度）
        3.2. IR-381和5-FU对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的CASPASE-3/7活性的影响
        3.3 细胞凋亡检测分析MIR-381和5-FU对786-0细胞凋亡的影响
        3.4 MIR-381和5-FU对肾癌细胞786-0细胞周期的影响
        3.5 WEE1回复实验及MIR-381增敏5-FU的机制
    4 讨论
    5 小结
结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间主要研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞周期中G1/S检验点的研究进展[J]. 舒丽娟.  中国医学工程. 2012(07)
[2]miRNA调控EMT与口腔癌化疗耐药关系的研究进展[J]. 张斌,黄洪章.  中国口腔颌面外科杂志. 2011(05)
[3]多基因遗传性肿瘤不同阶段转录组学调控规律及其分子机制[J]. 李夏雨,沈守荣,武明花,李小玲,熊炜,卢建红,周鸣,马健,向娟娟,曾朝阳,向波,周艳宏,肖岚,周厚德,范松青,李桂源.  中南大学学报(医学版). 2011(07)
[4]转移性肾癌药物靶向治疗的研究进展[J]. 穆家贵,王春阳,倪少滨.  中华临床医师杂志(电子版). 2011(11)
[5]WEE1与肝癌的关系[J]. 吕慧,杨玉秀,张立达,白阳秋.  世界华人消化杂志. 2011(14)
[6]miRNA与干细胞的生物学行为[J]. 张自强,刘玉梅,邓雯,吕琼霞.  中国组织工程研究与临床康复. 2011(10)
[7]IL-2联合5-氟尿嘧啶治疗晚期肾癌50例疗效观察[J]. 邹火生,黄裕清,李健,黄敏志.  昆明医学院学报. 2010(12)
[8]胃癌与癌旁组织miRNA差异表达谱的研究[J]. 张岱,王振宁,罗阳,徐岩,刘彦山,杨威,张学.  医学分子生物学杂志. 2010 (04)
[9]miRNA介导肿瘤生物学行为改变的研究进展[J]. 陈勇,左静,刘巍.  中国肿瘤生物治疗杂志. 2010(01)
[10]外周血miRNA作为肿瘤标志物的研究进展[J]. 万菁.  肿瘤. 2009(06)



本文编号：3020250