沉默p300及C/EBPβ对Thy-1肾炎大鼠肾组织产生促Th17分化因子和增生病变的影响及细胞特异性慢病毒载体的构建

发布时间：2021-03-29 05:47

　　第一部分沉默p300、C/EBPp基因对Thy-1肾炎大鼠肾组织产生促Th17分化因子和增生病变的影响目的:研究沉默大鼠肾内p300、CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT enhancer bindingproteinβ,C/EBPβ）基因表达对Thy-1肾炎大鼠肾组织产生IL-6、TGF-β1（促Th17分化因子）和增生病变的影响。方法:利用三质粒系统包装能表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）的 p300、C/EBPβ基因和乱序阴性对照小发夹RNA干扰慢病毒表达载体,经肾动脉灌注导入大鼠肾组织。在确定能抑制肾组织中p300、C/EBPβ的表达后再用兔抗Thy-1抗原的抗体复制Thy-1肾炎模型,并在肾炎发病后6h和3d收取标本,通过Real-time PCR和蛋白印迹（Westernblot）检查Thy-1肾炎大鼠肾组织中IL-6,TGF-β1和IL-17的表达情况。此外,在肾炎发病后第7d检查肾炎大鼠肾组织的病理学改变。结果:成功包装出能够表达EGFP的p300和C/EBPβ小发夹RNA干扰慢病毒表达载体,并建... 

【文章来源】：南京医科大学江苏省

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１?慢病毒载体构建所需质粒图谱

腹主动脉的肾动脉开口上下两端后逆行灌注，可以将慢病毒悬液注入大??鼠双肾，成功夹闭腹主动脉的肾动脉开口上下两端后，可以看到肾脏由??于缺血开始发白（图２Ｂ、Ｃ）。灌注完毕后，为了使慢病毒能有足够时??间侵染肾组织细胞，需夹闭肾门ｌＯｍｉｎ，同时松开腹主动脉上的血管夹??并压迫止血。尽快开放腹主动脉，使其能最大程度减少大鼠下肢缺血及??腹主动脉血流不畅所导致的下肢器官及心脏的损伤。由于而肾门夹闭时??间过短会影响慢病毒侵染效率，过长（超过１５ｍｉｎ）则可能导致肾脏的??缺血再灌注损伤

南京医科大学硕士学位论３将慢病毒三种质粒共转染２９３Ｔ细胞后４８ｈ，荧光显微镜检查转染效率（性对照慢病毒为例）。Ａ．白光视野；Ｂ．荧光视野。可见转染效率大于９０％??（ｘ２００）〇??由于本慢病毒具有ＣＭＶ启动的ＥＧＦＰ基因，因此我们使用倍比稀法转染２９３Ｔ细胞检测病毒滴度。将三种慢病毒液分别稀释１０倍、１００倍１０００倍、１００００倍后在９６孔板侵染２９３Ｔ细胞后７２ｈ，荧光显微镜下计ＥＧＦＰ阳性细胞个数，计算慢病毒滴度，得到慢病毒载体原液的滴度约ｌｘｌ〇８ＴＵ／ｍｌ?（图?４Ａ－Ｄ）。??


本文编号：3107022