ERCC6L介导MAPK通路调控肾癌细胞增殖、凋亡的相关研究

发布时间：2021-04-25 23:31

　　目的:肾细胞癌是世界上最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其基因学和细胞学的改变尚未被探索清楚。我们通过TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库信息查询,找到肾透明细胞癌增殖相关的数个备选基因,并通过生物信息学方法缩小选定基因范围,最终我们选定ERCCL6（excision repair cross-complementation group 6like）作为研究的目的基因,通过生信学分析ERCC6L可能与肾细胞癌的发展有关,这是基于ERCC6L在肾细胞癌组织中的表达增加,以及其可能与癌症的相关性。研究方法:通过28个癌/癌旁组织对照的肾细胞癌标本的分析,我们分析发现癌组织中ERCC6L的mRNA表达表达量明显升高,在含有150个肾细胞癌样本的组织芯片（TMA）中进行的免疫组织化学研究表明,ERCC6L的染色分数与肾癌的Fuhrman分级等级呈正相关。敲除ERCC6L的786-O和CAKI-1细胞的存活率明显降低,同时凋亡也相应地被诱导。在体实验中我们也发现敲除ERCC6L表达的裸鼠种瘤增长更慢。结果:检索TCGA数据库,寻找肾透明细胞癌中表达异常的基因,TCGA数据... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：79 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:TCGA数据库肾癌基因的生物信息学分析与筛选
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 临床标本
        2.2 细胞培养
        2.3 组织、细胞的RNA提取、反转录
            2.3.1 主要试剂
            2.3.2 主要器材
            2.3.3 试验步骤
        2.4 Mirco RNA反转录
        2.5 Real-time PCR检测
        2.6 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备
            2.6.1 实验材料
            2.6.2 实验试剂及仪器
            2.6.3 实验试剂的配制
        2.7 RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
            2.7.1 基因信息
            2.7.2 RNA干扰靶点设计
            2.7.3 DNA oligo序列合成
            2.7.4 双链DNA oligo制备
            2.7.5 电泳说明
        2.8 RNA干扰慢病毒载体构建
            2.8.1 连接
            2.8.2 转化
            2.8.3 引物
            2.8.4 PCR扩增
            2.8.5 阳性克隆测序结果分析
            2.8.6 质粒抽提
        2.9 细胞增殖筛选
            2.9.1 目的病毒
            2.9.2 Celigo细胞计数检测细胞增殖
            2.9.3 实验试剂
            2.9.4 实验步骤
        2.10 统计学分析
    3 结果
        3.1 TCGA数据库的生物信息学分析
            3.1.1 数据下载与拆分
            3.1.2 数据过滤与标准化
            3.1.3 差异基因列表获取
        3.2 待研究基因筛选
            3.2.1 待研目的基因范围的缩小
            3.2.2 表达与临床预后分析
            3.2.3 增殖功能筛选
    4 讨论
    5 结论
第二部分:ERCC6L在肾癌和细胞中的的表达量及细胞功能验证
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 细胞培养
        2.2 细胞的RNA提取
        2.3 反转录（reverse transcription PCR,RT-PCR）
        2.4 实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）
        2.5 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备
        2.6 RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
        2.7 RNA干扰慢病毒载体
        2.8 Western blot分析
            2.8.1 细胞总蛋白提取
            2.8.2 蛋白浓度测定
            2.8.3 SDS-PAGE电泳
            2.8.4 转印
            2.8.5 封闭,抗体标记及ECL发光检测
        2.9 FACS检测ERCC6L基因消减对凋亡的影响
        2.10 MTT检测ERCC6L基因消减对细胞增殖的影响
        2.11 统计学分析
    3 结果
        3.1 ERCC6L在肾癌细胞系中的表达
        3.2 ERCC6L在肾癌组织及癌旁组织中的表达
        3.3 检测mRNA水平ERCC6L基因消减效率
            3.3.1 qPCR检测mRNA水平ERCC6L基因消减效率
            3.3.2 Western Blot检测ERCC6L基因蛋白水平表达
        3.4 ERCC6L基因消减对细胞增殖的影响
            3.4.1 Celigo检测ERCC6L基因消减对细胞增殖的影响
            3.4.2 MTT检测ERCC6L基因消减对细胞增殖的影响
        3.5 FACS检测ERCC6L基因消减对凋亡的影响
    4 讨论
    5 结论
第三部分:动物实验验证ERCC6L的生物学功能、肾癌组织芯片中的表达分析以及基因芯片和IPA通路分析及验证
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备
        2.2 RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
        2.3 RNA干扰慢病毒载体构建
        2.4 动物实验
        2.5 组织芯片检测
        2.6 免疫组化
        2.7 人基因表达谱芯片和IPA通路分析
        2.8 实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）
        2.9 Western blot分析
        2.10 统计分析
    3 结果
        3.1 动物实验
        3.2 组织芯片
        3.3 人基因表达谱芯片和IPA通路分析
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述 肾癌发生发展的一些特征
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]1998-2008年中国肾癌发病趋势分析[J]. 韩苏军,王栋,李长岭,邢念增,张思维.  癌症进展. 2018(10)



本文编号：3160291