VX-765抑制caspase-1介导的细胞焦亡和炎症改善糖尿病肾脏损伤的机制研究
发布时间：2021-06-23 18:03
目的:目前世界范围内,糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）)是导致终末期肾脏疾病的首要原因。尽管严格的血压和血糖控制能够有效减缓1型或2型糖尿病所致糖尿病肾病的疾病进程,但仍不能完全阻止糖尿病肾病的发生和发展,因此迫切需要针对糖尿病肾病的新的治疗策略和方法。肾脏的微炎症状态目前已成为糖尿病肾病发生发展的重要基础。炎性小体的活化已在多种肾脏固有细胞中被报道,并在糖尿病肾病中得到证实。细胞焦亡是一种由炎性caspase-1、caspase-4、caspase-5（鼠caspase-1、caspase-11）所介导的炎症性程序性细胞死亡,是机体对感染和细胞损伤的免疫应答。这种溶解性的细胞死亡因具有细胞溶解和胞质内容物释放的特征而与细胞凋亡不同。这是一种由gasdermin D（GSDMD）介导的细胞膜裂孔形成并导致细胞肿胀和破裂的细胞死亡过程。作为一种先天免疫反应,细胞焦亡曾被认为是免疫细胞所特有的病理生理过程。然而,肾脏固有细胞是否通过细胞焦亡促进糖尿病肾病的发生,又是否可以通过细胞焦亡调控DN的进展目前尚不清楚。VX-765是一种有效的生物可利用的无毒小分子抑制剂...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
高糖刺激活化HK-2细胞NLRC4/caspase-1/GSDMD炎症信号通路
中国医科大学博士学位论文17干预后的细胞进行免疫共沉淀分析。细胞裂解液经过预处理后，使用抗NLRC4抗体来共沉淀NLRC4（诱饵蛋白，baitprotein），然后通过琼脂糖珠沉淀与NLRC4结合的caspase-1（靶蛋白，preyprotein），最后通过蛋白质免疫印迹法应用抗caspase-1抗体检测蛋白表达。如图1-2A所示，对比IgG对照组，在IgG重链55kDa以下45kDa位置检测到caspase-1表达，提示细胞裂解液中NLRC4与caspase-1结合，表明高糖刺激下HK-2细胞NLRC4/caspase-1炎性小体组装。为了进一步证实NLRC4是否能活化caspase-1，我们使用小干扰RNA（siRNA）敲减NLRC4的表达，并观察活性caspase-1p20片段表达变化。结果表明NLRC4敲减可显著抑制caspase-1活化（如图1-2B,C）。可见，糖尿病状态下HK-2细胞中NLRC4能够结合并活化caspase-1。图1-2.高糖刺激活化HK-2细胞NLRC4/caspase-1炎性小体A.免疫共沉淀分析表明高糖干预的HK-2细胞中NLRC4能够与caspase-1结合。B.蛋白质免疫印迹法检测结果表明在高糖环境下敲减HK-2细胞NLRC4表达，可显著抑制caspase-1p20活性片段生成。蛋白质免疫印迹结果的定量灰度分析见C。结果表示为均数±标准误。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。CL,cleaved;NTsiRNA,non-targetsiRNA;Veh,vehicle;Gluc,glucose。3.1.3光学显微镜观察高糖环境下肾小管上皮细胞形态学改变为了初步评估高糖处理后肾小管上皮细胞是否发生细胞焦亡，于显微镜下观察
中国医科大学博士学位论文1825mMD-葡萄糖干预48小时后细胞形态改变。同时以甲磺酸盐（Val-boroPro）为诱导细胞焦亡的阳性对照。已有研究表明Val-boroPro可激动caspase-1从而诱导细胞焦亡[27]；以依托泊苷（etoposide）为诱导细胞凋亡的阳性对照，已知依托泊苷可通过抑制DNA拓扑异构酶II诱导细胞凋亡[26]。蛋白质免疫印迹法分析Val-boroPro或依托泊苷处理细胞24小时后的炎性caspase-1和凋亡caspase-3蛋白表达情况，结果证实Val-boroPro可剪切活化caspase-1，而依托泊苷活化caspase-3（如图1-3A,B）。显微镜下观察高糖、Val-boroPro和依托泊苷处理后的HK-2细胞形态改变，可见高糖处理的细胞表现出与Val-boroPro组相似的焦亡样形态改变（细胞膜膨胀）（如图1-3C），提示高糖处理肾小管上皮细胞可能发生细胞焦亡。图1-3.光镜下高糖环境中HK-2细胞形态改变A.蛋白质免疫印迹法检测Val-boroPro（5μM）和依托泊苷（25μM）干预24小时后炎性caspase-1和凋亡caspase-3表达情况，并以DMSO处理为对照组。B.蛋白质免疫印迹结果的定量灰度分析。C.光镜下观察到高糖处理后HK-2细胞表现出与Val-boroPro处理后相似的细胞膜膨胀的细胞焦亡样形态改变。星号表示焦亡细胞的气球样改变细胞膜特征。箭头表示凋亡细胞的葡萄串样细胞膜出泡。结果表示为均数±标准误。*p<0.05,***p<0.001。VbP,Val-boroPro;Etop.,etoposide;FL,fulllength;CL,cleaved。3.1.4共聚焦显微镜分析发生焦亡的肾小管上皮细胞形态学改变
本文编号：3245408
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
高糖刺激活化HK-2细胞NLRC4/caspase-1/GSDMD炎症信号通路
中国医科大学博士学位论文17干预后的细胞进行免疫共沉淀分析。细胞裂解液经过预处理后，使用抗NLRC4抗体来共沉淀NLRC4（诱饵蛋白，baitprotein），然后通过琼脂糖珠沉淀与NLRC4结合的caspase-1（靶蛋白，preyprotein），最后通过蛋白质免疫印迹法应用抗caspase-1抗体检测蛋白表达。如图1-2A所示，对比IgG对照组，在IgG重链55kDa以下45kDa位置检测到caspase-1表达，提示细胞裂解液中NLRC4与caspase-1结合，表明高糖刺激下HK-2细胞NLRC4/caspase-1炎性小体组装。为了进一步证实NLRC4是否能活化caspase-1，我们使用小干扰RNA（siRNA）敲减NLRC4的表达，并观察活性caspase-1p20片段表达变化。结果表明NLRC4敲减可显著抑制caspase-1活化（如图1-2B,C）。可见，糖尿病状态下HK-2细胞中NLRC4能够结合并活化caspase-1。图1-2.高糖刺激活化HK-2细胞NLRC4/caspase-1炎性小体A.免疫共沉淀分析表明高糖干预的HK-2细胞中NLRC4能够与caspase-1结合。B.蛋白质免疫印迹法检测结果表明在高糖环境下敲减HK-2细胞NLRC4表达，可显著抑制caspase-1p20活性片段生成。蛋白质免疫印迹结果的定量灰度分析见C。结果表示为均数±标准误。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。CL,cleaved;NTsiRNA,non-targetsiRNA;Veh,vehicle;Gluc,glucose。3.1.3光学显微镜观察高糖环境下肾小管上皮细胞形态学改变为了初步评估高糖处理后肾小管上皮细胞是否发生细胞焦亡，于显微镜下观察
中国医科大学博士学位论文1825mMD-葡萄糖干预48小时后细胞形态改变。同时以甲磺酸盐（Val-boroPro）为诱导细胞焦亡的阳性对照。已有研究表明Val-boroPro可激动caspase-1从而诱导细胞焦亡[27]；以依托泊苷（etoposide）为诱导细胞凋亡的阳性对照，已知依托泊苷可通过抑制DNA拓扑异构酶II诱导细胞凋亡[26]。蛋白质免疫印迹法分析Val-boroPro或依托泊苷处理细胞24小时后的炎性caspase-1和凋亡caspase-3蛋白表达情况，结果证实Val-boroPro可剪切活化caspase-1，而依托泊苷活化caspase-3（如图1-3A,B）。显微镜下观察高糖、Val-boroPro和依托泊苷处理后的HK-2细胞形态改变，可见高糖处理的细胞表现出与Val-boroPro组相似的焦亡样形态改变（细胞膜膨胀）（如图1-3C），提示高糖处理肾小管上皮细胞可能发生细胞焦亡。图1-3.光镜下高糖环境中HK-2细胞形态改变A.蛋白质免疫印迹法检测Val-boroPro（5μM）和依托泊苷（25μM）干预24小时后炎性caspase-1和凋亡caspase-3表达情况，并以DMSO处理为对照组。B.蛋白质免疫印迹结果的定量灰度分析。C.光镜下观察到高糖处理后HK-2细胞表现出与Val-boroPro处理后相似的细胞膜膨胀的细胞焦亡样形态改变。星号表示焦亡细胞的气球样改变细胞膜特征。箭头表示凋亡细胞的葡萄串样细胞膜出泡。结果表示为均数±标准误。*p<0.05,***p<0.001。VbP,Val-boroPro;Etop.,etoposide;FL,fulllength;CL,cleaved。3.1.4共聚焦显微镜分析发生焦亡的肾小管上皮细胞形态学改变
本文编号：3245408
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