一种可反映人精子DNA损伤严重程度的流式细胞术的建立及评价

发布时间：2021-07-16 09:14

　　目的:建立一种可反映人精子DNA损伤严重程度的流式细胞检测技术,并对其性能进行评价。方法:DNA损伤精子（单链DNA）与荧光染料吖啶橙（AO）结合后发红色荧光,而DNA完整精子（双链DNA）与AO结合后发绿色荧光。通过对1 165例人精液样本正常精子群的红色荧光和绿色荧光峰图的分析,确定红色荧光的95%的平均上限和绿色荧光的5%的平均下限为十字象限门的红色荧光和绿色荧光界限,建立精子DNA碎片指数（DFI）的流式细胞检测技术,并分析其重复性和线性范围,确定正常生育男性的参考值。并对122例不育门诊男性的精子DFI、轻度DNA损伤（DFIm）和重度DNA损伤（DFIs）与精子浓度及活力的相关性进行分析。结果:利用十字象限门建立的流式细胞术,可以很明显地区分不同人群的精子DFI、DFIm和DFIs。高、中、低DFI的精液样本使用流式细胞术重复检测10次,所得CV均低于5%。精子DFI在8.93%～53.90%范围内有极好的相关性,相关系数r> 0.99。基于274例正常生育男性的精子DFI结果,以95%上限确定正常参考值范围,正常生育男性精子DFI≤25.50%。精子DFI与精子浓度... 

【文章来源】：中华男科学杂志. 2020,26(11)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

不同人群的精子DFI流式细胞图

现有的精子DFI的SCSA法的不合理性就体现在流式细胞结果分析上。本研究确定的流式细胞结果分析方案如下:①象限门的确定:综观流式细胞术相关图书[8-9],对各类细胞的分析几乎毫无例外地采用十字象限门,精子作为人类细胞的一种同样适用。十字象限门的关键是确定十字象限的交叉点,对AO染色的精子而言,就是正常精子最低绿色荧光和最高红色荧光的界限,低于此界限的非特异荧光基本来自细胞碎片或微小颗粒杂质,这部分在进行细胞分析时应予扣除。基于此,本研究基于大量样本(1 165例)的正常精子群的绿色荧光和红色荧光峰图,确定绿色荧光的5%的平均下限和红色荧光的95%的平均上限为十字象限门的绿色荧光和红色荧光界限(图1)。②DFI的确定:十字象限门一旦确定,各象限的细胞特性基本确定,Q3-3象限为非特异性荧光,予以扣除;Q3-1象限为正常精子,精子DNA未断裂,AO结合量少而呈绿色荧光;Q3-2为DNA部分断裂细胞,荧光显微镜下细胞核被染成桔黄色,这部分细胞的DNA有可能被修复[12],我们称之为轻度DNA损伤精子(mild DNA fragmentation,DFIm);Q3-4为含碎片化DNA细胞,荧光显微镜下细胞核被染成红色,我们称之为重度DNA损伤精子(severe DNA fragmentation,DFIs)。Q3-2和Q3-4象限的精子均应为DNA发生断裂的精子,两者之和即为DFI。1.4 精子DFI流式细胞术检测的重复性分析

见表3、4。精子DFI与精子浓度没有显著相关性,但与精子活动率和前向运动精子百分率呈显著负相关,尤以DFIs与精子活动率和前向运动精子百分率的相关性更高。进一步以精子活动率和前向运动精子百分率正常与否分组,观察两组的DFI、DFIm和DFIs的差异,结果显示,精子活动率和前向运动精子百分率降低组的精子DFI、DFIm和DFIs均显著高于精子活动率和前向运动精子百分率正常组,尤以DFIs的差异最为显著。图4 正常生育男性精子DFI参考值的确定

【参考文献】：
期刊论文
[1]Critical evaluation of two models of flow cytometers for the assessment of sperm DNA fragmentation:an appeal for performance verification[J]. Rakesh Sharma,Sajal Gupta,Ralf Henkel,Ashok Agarwal.  Asian Journal of Andrology. 2019(05)
[2]精子DNA碎片指数与精液参数的相关性分析[J]. 帅俊,吴亮,高一博,史昊,孙莹璞.  中华男科学杂志. 2019(02)
[3]应规范男科实验室的检测项目[J]. 陆金春.  中华医学杂志. 2018 (46)
[4]精子DNA损伤检测的临床应用价值及面临的问题[J]. 陆金春.  中华医学杂志. 2015 (36)
[5]精子DNA损伤的相关因素研究进展[J]. 陆金春.  中华男科学杂志. 2015(08)



本文编号：3286725