SPAG6/SPINK2蛋白复合物在小鼠精子顶体形成的作用初探

发布时间：2021-07-30 14:43

　　目的:研究与探讨精子相关抗原6（SPAG6）在小鼠精子发生过程中顶体形成阶段的表达及其调控作用。方法:以小鼠睾丸组织cDNA为模板PCR扩增SPAG6和SPINK2蛋白编码区域,构建pGBKT7/SPAG6、pGADT7/SPINK2、pEGFP-N2/SPAG6和pCS3+FLT/SPINK2表达质粒,并通过酶切鉴定重组表达质粒是否构建成功;分别收集处于第一波精子发生阶段（出生后8、12、16、20、24、28、30和35天）雄性小鼠睾丸组织,Western blot研究第一波精子发生中SPAG6的表达情况;分离成年雄性小鼠睾丸组织混合生精细胞,免疫荧光观察SPAG6在生精细胞中的定位;将构建的pGBKT7/SPAG6和pGADT7/SPINK2表达质粒转化到AH109感受态细胞,直接酵母双杂交实验验证SPAG6与SPINK2蛋白间相互作用;将pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2表达质粒转染到CHO细胞,免疫荧光染色后观察SPAG6与SPINK2在细胞中的定位情况;将pCS3+FLT/SPINK2和pEGFP-N2/SPAG6表达质粒转染到COS-1细胞,免疫共... 

【文章来源】：武汉科技大学湖北省

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写对照表
第1章 前言
第2章 材料
    2.1 实验主要试剂
    2.2 实验主要菌株和载体
    2.3 实验主要仪器
    2.4 实验动物
    2.5 主要实验试剂的配制
        2.5.1 10%SDS溶液
        2.5.2 5×TBE电泳缓冲液溶液
        2.5.3 1%电泳凝胶
        2.5.4 LB液体培养基
        2.5.5 LB固体培养基
        2.5.6 RIPA Buffer缓冲液
        2.5.7 10×TBST溶液
第3章 方法
    3.1 小鼠睾丸组织总RNA提取及CDNA合成
        3.1.1 小鼠睾丸组织总RNA提取
        3.1.2 小鼠睾丸组织总RNA逆转录合成cDNA
    3.2 质粒构建
        3.2.1 Spag6和Spink2引物设计
        3.2.2 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)
        3.2.3 PCR产物的凝胶电泳鉴定
        3.2.4 PCR产物的回收纯化
        3.2.5 TA克隆及其连接产物的转化
        3.2.6 阳性菌落的质粒提取
        3.2.7 pClone007/SPAG6和pClone007/SPINK2 重组质粒酶切及基因测序验证
        3.2.8 目的片段SPAG6、SPINK2及目标载体的回收纯化
        3.2.9 目的片段SPAG6、SPINK2与目标载体的连接转化
        3.2.10 SPAG6和SPINK2 重组质粒酶切鉴定
    3.3 小鼠睾丸组织总蛋白提取与测定
        3.3.1 小鼠睾丸组织总蛋白提取
        3.3.2 小鼠睾丸组织总蛋白测定
    3.4 Western blot检测小鼠睾丸组织蛋白表达
        3.4.1 小鼠睾丸组织中SPAG6蛋白的表达
        3.4.2 Spag6基因敲除小鼠睾丸组织中SPINK2表达
    3.5 免疫荧光观察SPAG6在生精细胞中的定位
        3.5.1 小鼠混合生精细胞的分离
        3.5.2 生精细胞免疫荧光染色
    3.6 直接酵母双杂交实验验证SPAG6和SPINK2 蛋白间相互作用
        3.6.1 酵母感受态细胞的制备
        3.6.2 pGBKT7/SPAG6+ pGADT7/SPINK2 混合质粒转化入酵母感受态细胞
    3.7 细胞内共定位实验验证SPAG6与SPINK2 蛋白间的相互作用
        3.7.1 重组质粒pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2 转染至CHO细胞
        3.7.2 CHO细胞的免疫荧光染色
    3.8 免疫共沉淀实验验证SPAG6与SPINK2 蛋白间的相互作用
    3.9 SPINK2在Spag6基因敲除小鼠睾丸生精细胞中的表达与定位
第4章 结果
    4.1 SPAG6和SPINK2重组质粒的鉴定
    4.2 第一波精子发生中SPAG6蛋白表达水平
    4.3 SPAG6 定位于圆形精子的顶体
    4.4 直接酵母双杂交实验验证SPAG6和SPINK2 蛋白间相互作用
    4.5 细胞内共定位实验验证SPAG6与SPINK2 蛋白间的相互作用
    4.6 免疫共沉淀实验验证SPAG6与SPINK2蛋白间的相互作用
    4.7 SPAG6蛋白缺失可能导致小鼠精子顶体形成受阻
第5章 讨论
第6章 结论与展望
致谢
参考文献
综述
    参考文献
附录1 质粒载体图谱
附录2 攻读硕士学位期间发表的论文
附录3 攻读硕士学位期间参加的科研项目


【参考文献】：
期刊论文
[1]溶质载体家族22成员14和精子相关抗原6在特发性弱精子症患者精子中的表达[J]. 侯方圆,李玉山,杨夕阳,王全先,刘军杰,王琳凯,苏彦华,孙琳.  中华男科学杂志. 2017(08)
[2]泛素?蛋白酶体途径在精子生成中的作用[J]. 董莲花,冉茂良,李智,彭馥芝,陈斌.  遗传. 2016(09)
[3]精子表观遗传缺陷与男性不育相关性的研究进展[J]. 马国燕,卢静,张秀青.  中国计划生育学杂志. 2016(05)
[4]小鼠精子顶体形成相关基因研究进展[J]. 牛长敏,郭佳倩,马海涛,郑哲,郑英.  中华男科学杂志. 2016(01)
[5]ARM结构的缺失对SPAG6在哺乳细胞中定位的影响[J]. 汪智琼,张玲,石玉琴,李红飞,张志兵.  中国男科学杂志. 2015 (01)
[6]男性不育的表观遗传学研究进展[J]. 刘运强,卢永杰,张思仲.  中华医学遗传学杂志. 2014 (02)
[7]精子DNA损伤在男性不育中的诊断价值[J]. 费前进,黄航,金建远,黄学锋.  中华医学遗传学杂志. 2014 (01)
[8]不孕不育症的实验室研究进展[J]. 徐文莉,李康,罗艺.  检验医学与临床. 2012(16)
[9]高氟地区男性不育患者1例报道[J]. 石修权,刘丹,谭礼春.  中国地方病学杂志. 2012 (04)



本文编号：3311597