噬菌体展示技术体内筛选人膀胱癌细胞特异性结合肽

发布时间：2017-04-28 14:15

  本文关键词：噬菌体展示技术体内筛选人膀胱癌细胞特异性结合肽，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用噬菌体展示技术通过体内筛选的方法得到能够和人膀胱移行细胞癌BIU87细胞特定结合起来的小分子多肽。方法:将人膀胱移行细胞癌BIU87细胞接种于裸鼠体内,制备膀胱癌荷瘤裸鼠模型。经荷瘤裸鼠尾静脉将噬菌体展示环七肽库注入其体内,筛选可同膀胱移行细胞癌组织特异性结合的单克隆噬菌体。经过三轮体内筛选后,运用免疫组织化学法显示噬菌体在体内肿瘤及各组织的分布情况,同时随机挑取三十个单克隆噬菌体,运用酶联免疫法观察噬菌体对人膀胱移行细胞癌BIU87细胞亲和力大小。将阳性表达的噬菌体DNA提取出来,并进行序列测定,推算出插入多肽的氨基酸序列,通过软件库进行同源性比对分析。多肽通过固相合成法合成,并标记荧光素异硫氰酸成为荧光探针。MTT法检测多肽及荧光探针对BIU87细胞的毒性。激光扫描共焦显微镜术和流式细胞术鉴定荧光探针对人膀胱移行细胞癌BIU87细胞的亲和性。免疫荧光组织化学法鉴定荧光探针对膀胱肿瘤患者病理组织的特异性。结果:1环七肽库经尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内,噬菌体滴度及组化染色结果显示:随着筛选逐轮进行,噬菌体在荷瘤裸鼠的膀胱肿瘤组织中出现明显富集,当筛选到第三轮结束时,回收率是首轮筛选结束后的4.334×102倍;肝脏与肾脏组织因血管丰富、代谢速度快等特点,可以非特异的吸附大量噬菌体肽库,而膀胱、肺与肌肉组织只有少量噬菌体肽库结合。2体内筛选三轮结束后,随机挑取三十个蓝色单克隆噬菌体,利用酶免法初步检测单克隆噬菌体对BIU87细胞的亲和力,结果显示:共有二十四个单克隆噬菌体亲和力≥2,是阳性表达的噬菌体克隆,阳性率达80%,其中有十个单克隆噬菌体亲和力≥5,将其扩增并对DNA进行提取、测序、翻译,共获得三条序列:CSSPIGRHC(8/10)、CTMSNLKGC(1/10)及CNNVLSQMC(1/10)。将重复率最高的多肽序列CSSPIGRHC命名为NYZL1,运用Ex PASy/Prot Param、NCBI/BLAST等数据库分析,上述序列之间没有同源性,NYZL1与目前所知的基因和蛋白没有发现同源性,且国内外文献均没有相关报道。3固相合成NYZL1及FITC-NYZL1,并与BIU87细胞孵育,PBS作空白对照,观察多肽及荧光探针对BIU87细胞的毒性,结果表明多肽及荧光探针在~100μmol/L浓度范围内孵育细胞24小时,对BIU87细胞的增殖及活性无影响,同时表明荧光标记物FITC不会破坏多肽NYZL1的分子构象。4将FITC-NYZL1及FITC-sv NYZL1与BIU87细胞孵育,PBS作空白对照,使用共聚焦显微镜镜下观察其结合情况,结果表明FITC-NYZL1在BIU87细胞上有高富集荧光亮点,且均匀结合于细胞质与细胞核中,表明FITC-NYZL1与BIU87细胞具有亲和力和特异性。5将FITC-NYZL1及FITC-sv NYZL1与BIU87细胞孵育后流式细胞仪观察,结果显示FITC-NYZL1与BIU87细胞结合的荧光强度值为53.1925±1.35,FITC-sv NYZL1与BIU87细胞结合的荧光强度值为15.17±1.06,PBS空白对照荧光强度值为6.67±0.10,P0.01,差异在统计学中有意义,表明FITC-NYZL1与BIU87细胞具有亲和力和特异性。6将FITC-NYZL1、FITC-sv NYZL1分别孵育膀胱肿瘤患者病理组织及癌旁正常膀胱组织石蜡切片,荧光显微镜观察结果显示,在膀胱肿瘤组织切片中,FITC-NYZL1组荧光富集度高,平均荧光强度为1974.04±407.57,FITV-sv NYZL1组荧光很弱,平均荧光强度为140.07±178.23,而在癌旁正常膀胱组织切片中,两组荧光显示都很弱,平均荧光强度值分别为349.27±46.29、155.79±143.37,表明FITC-NYZL1能特异性的结合于膀胱肿瘤组织,且亲和力高。结论:本次实验快速有效的构建了BIU87细胞荷瘤裸鼠模型,通过体内筛选获得了能够与膀胱肿瘤细胞特定结合的多肽NYZL1,并进一步证实FITC-NYZL1对膀胱尿路癌细胞及组织的特异性,显示人膀胱移行细胞癌BIU87细胞表面有多肽NYZL1的特异性结合位点。多肽NYZL1可能成为膀胱癌相关抗原的新配体,为诊断早期膀胱癌和靶向性治疗提供一定的理论依据。
【关键词】：膀胱癌 噬菌体展示技术 BIU87细胞
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-12
• 前言12-15
• 1 材料与方法15-26
• 1.1 实验材料、试剂与仪器15-18
• 1.2 实验方法18-26
• 2 结果26-35
• 2.1 成功建立异体移植BIU87 细胞荷瘤裸鼠模型26
• 2.2 噬菌体展示环七肽库体内筛选膀胱癌细胞靶向肽26-27
• 2.3 噬菌体肽库在肿瘤及其他组织的分布情况27-28
• 2.4 阳性噬菌体克隆与膀胱癌细胞的亲和力28-29
• 2.5 膀胱癌细胞特异结合的噬菌体DNA的测序29-31
• 2.6 化学合成肽31-32
• 2.7 MTT鉴定多肽及荧光探针的细胞毒性32
• 2.8 共焦显微镜术鉴定荧光探针与BIU87 细胞的特异性32-33
• 2.9 流式细胞术鉴定荧光探针与BIU87 细胞的特异性33-34
• 2.10 免疫荧光鉴定探针的组织特异性34-35
• 3 讨论35-39
• 4 结论39-40
• 参考文献40-43
• 附图43-44
• 综述44-50
• 参考文献48-50
• 致谢50-52
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果52-53
• 个人简历53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨国良;薄隽杰;;尿液中膀胱肿瘤标志物检测的研究进展[J];中国癌症杂志;2009年07期

  本文关键词：噬菌体展示技术体内筛选人膀胱癌细胞特异性结合肽，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：332980