ShRNA介导RNA干扰对肾癌细胞OS-RC-2原癌基因Pokemon的抑制作用

发布时间：2021-08-16 12:19

　　目的探讨肾癌中Pokemon蛋白的表达及其与临床病理特征的关系；构建Pokemon shRNA重组质粒,观察携带shRNA的重组质粒对肾癌细胞OS-RC-2增殖及凋亡的影响。方法1.采用免疫组织化学SP法检测64例肾癌、10例癌旁组织、20例肾良性肿瘤Pokemon蛋白的表达,并对其与临床病理特征的关系进行分析；2.构建针对Pokemon原癌基因的shRNA重组质粒并对其鉴定；3.采用脂质体LipofactamineTM2000介导转染OS-RC-2细胞,观察转染效率和细胞形态的变化；应用实时荧光定量PCR从1mRNA水平检测shRNA重组质粒对Pokemon基因的抑制情况；4.MTT法分析Pokemon重组质粒转染OS-RC-2细胞的增殖变化；5.流式细胞术分析Pokemon重组质粒转染OS-RC-2细胞的凋亡变化。结果1.Pokemon蛋白表达于肾癌细胞核和细胞质。肾癌细胞Pokemon蛋白高表达率为71.9%,显著高于癌旁组织30%、肾良性肿瘤35%,具有统计学意义（P<0.05）；2.肾细胞癌组织中pokemon蛋白的表达与肿瘤组织分级有关,而与患者的性别、年龄、临床分期... 

【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
英文缩写表
技术路线
前言
第一章 实验材料
    1.1 临床标本
    1.2 主要试剂
    1.3 菌种、质粒、细胞株
    1.4 主要仪器
    1.5 试剂配制方法
        1.5.1 免疫组织化学试剂配制
        1.5.2 质粒构建试剂的配制
        1.5.3 细胞培养试剂配制
第二章 实验方法
    2.1 Pokemon在肾癌组织中的表达
        2.1.1 制备蜡块
        2.1.2 切片
        2.1.3 HE染色
        2.1.4 S-P免疫组化染色步骤
        2.1.5 结果判断
        2.1.6 统计学方法
    2.2 Pokemon shRNA重组质粒的构建
        2.2.1 干扰序列设计
        2.2.2 序列合成
        2.2.3 单链目的基因磷酸化和退火
        2.2.4 pSHH-H1质粒酶切及回收
        2.2.5 线性质粒pSHH-H1与退火片段的连接
        2.2.6 制备感受态细菌
        2.2.7 转化感受态
        2.2.8 重组质粒的筛选及提取
        2.2.9 DNA序列测定
    2.3 shRNA重组质粒对OS-RC-2细胞中Pokemon的作用
        2.3.1 细胞培养
        2.3.2 细胞转染
        2.3.3 细胞形态学观察
        2.3.4 细胞总RNA的提取
        2.3.5 cDNA合成
        2.3.6 引物设计
        2.3.7 PCR反应
        2.3.8 数据分析设置
        2.3.9 MTT法分析细胞增殖
        2.3.10 流式细胞仪分析细胞凋亡
        2.3.11 统计学分析
第三章 实验结果
    3.1 Pokemon在肾癌组织中的表达及意义
        3.1.1 Pokemon蛋白在肾癌癌组织和癌旁正常组织中的表达
        3.1.2 Pokemon蛋白在肾癌中的表达与临床病理学指标的关系
    3.2 shRNA重组质粒对OS-RC-2细胞中Pokemon的抑制作用
        3.2.1 shRNA重组质粒的鉴定
        3.2.2 转染后细胞的镜下观察
        3.2.3 shRNA重组质粒对Pokemon mRNA表达的抑制
        3.2.4 shRNA重组质粒对细胞生长活性的影响
        3.2.5 shRNA重组质粒对细胞凋亡的影响
第四章 结论
    4.1 主要结论
    4.2 讨论
    4.3 研究展望
参考文献
综述
    参考文献
在学期间的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]原癌基因pokemon的mRNA在肾癌中的表达及其意义[J]. 侯列军,郑军华,耿江,顾闻宇,王波.  中国现代医生. 2011(27)
[2]Pokemon在人贲门癌中的表达及其意义（英文）[J]. 曹国春,王会,黄亚玲,王庆玲,侯亚义.  南京大学学报(自然科学版). 2010(01)
[3]Pokemon在鼻咽癌中的表达及临床意义[J]. 高伟,隋军,李晓江,马静,任艳鑫.  现代肿瘤医学. 2009(01)
[4]Pokemon蛋白在乳腺癌中的表达及意义[J]. 崔明,徐海,杨彦.  临床外科杂志. 2007(06)
[5]CDKN2A位点p16INK4α、p14ARF基因变异与胃癌发生的关系[J]. 汤绍辉,杨冬华,罗和生,于皆平,舒建昌.  中华流行病学杂志. 2004(06)
[6]肾癌525例临床分析[J]. 潘柏年,徐仁方,郭晓,何志嵩,杨勇,张晓春,周利群,郝金瑞,那彦群,薛兆英,郭应禄.  中华泌尿外科杂志. 2000(03)



本文编号：3345660