肾癌组织特异性复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

发布时间：2017-05-04 01:05

  本文关键词：肾癌组织特异性复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:构建肾癌组织特异性复制缺陷型5型腺病毒Ad5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1,该病毒携带肾癌组织特异性启动子碳酸酐酶IX和报告基因人源型绿色荧光蛋白(hrGFP-1),为外周血中循环肿瘤细胞(CTCs)的检测等后续研究奠定基础。方法:利用BglII、PmeI双酶切穿梭质粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1、pShuttle-CAIX-E1A分别得到目的片段hrGFP-1及基因载体,T4 DNA连接酶过夜连接,构建含有报告基因的重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-IERS-hrGFP-1。转化感受态细胞DH5α后经涂板、PCR、酶切鉴定,挑选阳性菌落大量扩增,获取重组质粒。提取的阳性质粒经PmeI线性化,转化含有骨架质粒AdEasy-1的感受态细胞BJ5183,利用同源重组技术,构建病毒质粒pAd5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1。经PCR、酶切共同鉴定,阳性质粒转化入感受态细胞DH5α中大量扩增、提取并冻存菌液。阳性质粒经PacI酶切后,线性化质粒利用Lipofectamin 2000TM介导作用,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1,经4轮扩增后收集、纯化病毒,检测其滴度。结果:成功构建重组穿梭质粒、重组腺病毒质粒并且完成其包装过程。PCR和酶切的电泳结果显示,hrGFP-1基因成功嵌入重组穿梭质粒及腺病毒质粒,酶切分析与Vector NTI Advance 11软件结果一致,证实重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1及腺病毒质粒pAd5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1构建正确;在病毒包装和后续四轮扩增过程中,重组腺病毒在HEK293细胞内荧光表达正常,细胞病变明显,证实病毒包装成功,经检测其滴度为1.87×1010pfu/ml。结论:携带报告基因的肾癌组织特异性复制缺陷型5型腺病毒构建成功,重组后的病毒Ad5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1,为外周血中肾癌循环肿瘤细胞的检测奠定基础,为后续肾癌单细胞基因分析、判断患者肾癌分期、预后及指导个体化治疗提供新的契机。
【关键词】：肾癌 循环肿瘤细胞 碳酸酐酶IX启动子 人源化绿色荧光蛋白 重组腺病毒 HEK293细胞
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文缩略词6-9
• 前言9-13
• 1 材料和方法13-21
• 1.1 实验材料13-15
• 1.1.1 质粒、菌株及细胞13
• 1.1.2 实验试剂13
• 1.1.3 实验试剂盒13
• 1.1.4 设备及仪器13-14
• 1.1.5 主要溶液及配制14-15
• 1.2 实验方法15-21
• 1.2.1 重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1 的构建及鉴定15-17
• 1.2.2 重组病毒质粒的构建及鉴定17-19
• 1.2.3 重组腺病毒包装及扩增19-21
• 2 结果21-24
• 2.1 原有质粒鉴定21
• 2.2 重组穿梭质粒鉴定21-23
• 2.3 重组腺病毒质粒鉴定23
• 2.4 重组腺病毒的包装、扩增及病毒滴度测定23-24
• 3 讨论24-29
• 4 结论29-30
• 参考文献30-35
• 综述35-42
• 参考文献39-42
• 在学期间科研成果42-43
• 致谢43

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