量子点免疫荧光双色标记检测醛糖还原酶和Toll样受体4在细胞模型及糖尿病大鼠肾脏组织中的表达

发布时间：2017-05-12 15:12

  本文关键词：量子点免疫荧光双色标记检测醛糖还原酶和Toll样受体4在细胞模型及糖尿病大鼠肾脏组织中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是严重危害人类健康的主要慢性疾病之一,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)约占糖尿病人群的1/3,发病机制复杂,可能涉及到多种因素,包括醛糖还原酶(Aldose reductase, AR)和Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)。AR是糖代谢多元醇通路中的关键限速酶。AR过度表达不仅在糖尿病并发症中发挥着重要作用,还可能参与体内多种信号通路的调节,尤其是炎症反应。多项研究表明DN不只是代谢相关性疾病,亦是免疫及炎症相关性疾病,炎症反应可导致DN发生肾小管损伤。TLR4通过识别和结合病原相关分子参与细胞跨膜信号转导通路,从而介导机体炎症反应,被认为是哺乳动物体内发现的介导炎症反应的关键跨膜蛋白。特异性蛋白标志物的有效检测对于疾病的诊断和治疗有重要价值。常用的病理学检测手段包括免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC)和免疫荧光染色法。但这两种方法不易实现同一组织切片多种蛋白的同时检测。量子点(Quantum dots,QDs)是一种新型的纳米荧光材料,具着优良的光学特性,是生物标志物检测,尤其是多种标志物同时检测的理想荧光探针。目的：研究AR和TLR4在细胞模型及糖尿病大鼠模型中的表达和意义,为糖尿病肾病的诊断和治疗提供新思路。并利用量子点免疫荧光双色标记同时检测AR和TLR4在肾组织中的表达,为探讨二者的关系及量子点标记技术在疾病诊断及治疗中的价值奠定基础。方法：1、转染含人醛糖还原酶基因的质粒,构建AR高表达的细胞模型;2、制备及检测QD-anti-AR、QD-anti-TLR4复合物荧光探针;3、免疫细胞化学法和量子点免疫荧光标记法检测及定位COS-7细胞模型中AR的表达;4、糖尿病大鼠肾组织的病理学HE染色;5、传统IHC和量子点免疫荧光标记法检测AR和TLR4在糖尿病大鼠肾组织中的表达;6、量子点免疫荧光双色标记法同时检测糖尿病大鼠肾组织中AR和TLR4的表达。结果：1、免疫细胞化学法和荧光显微镜观察质粒转染情况均证实AR高表达的COS-7细胞模型构建成功,并利用量子点免疫荧光标记法准确定位了AR在细胞中的表达部位,位于细胞浆和细胞膜;2、大鼠肾组织HE染色显示：糖尿病大鼠肾小球体积明显增大,肾小管上皮细胞出现空泡变性,提示该组大鼠出现糖尿病肾病早期病变；3、利用传统IHC和量子点免疫荧光标记法检测到在糖尿病大鼠肾组织中AR表达上调,其表达部位为肾小球毛细血管和肾间质血管；4、利用传统IHC和量子点免疫荧光标记法检测到在糖尿病大鼠肾小管TLR4表达上调,其中在发生空泡变性的肾小管表达更明显;5、运用量子点免疫荧光双色标记首次同时检测到AR和TLR4在糖尿病大鼠肾组织的高表达,两种蛋白的表达部位与单独检测的结果一致；6、通过蛋白偶联剂EDC分别将羧基修饰QDs与AR抗体和TLR4抗体成功偶联,并采用琼脂糖凝胶电泳检测偶联产物,得到QDs与抗体的最佳偶联比：7、在对细胞和组织AR和TLR4蛋白的检测中,优化的QDs免疫荧光标记技术包括QDs与抗体的复合物探针及亲和素化的量子点,均显示出良好的特异性和敏感性,其实验步骤方便快捷,非特异性着色较传统IHC少。结论：1、成功构建了AR高表达的COS-7细胞模型,并准确定位了AR的表达部位,为靶向性筛选ARIs奠定了基础;2、通过IHC直观的观察到AR在糖尿病大鼠肾组织的分布情况,表明AR参与DN的发病进程,且有可能作为DN发生发展的监测指标;3、TLR4在糖尿病大鼠发生空泡变性的肾小管中高表达,表明TLR4通过炎症反应介导DN的发生发展;4、首次运用量子点免疫荧光双色标记同时检测到AR和TLR4在糖尿病大鼠肾组织的高表达,提示AR和TLR4蛋白共同参与了DN的发病过程,两者可能在介导炎症反应方面存在一定联系；5、优化的QDs免疫荧光标记技术显示出良好的特异性和敏感性,在多色标记方面是对传统IHC方法的有益补充。为探讨多种蛋白在疾病发生发展机制中的相互关系提供了有力依据。
【关键词】：糖尿病肾病 醛糖还原酶 Toll样受体4 量子点 免疫荧光标记
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一部分 醛糖还原酶在真核细胞模型的表达及意义16-28
• 材料与方法17-23
• 结果23-26
• 讨论26-28
• 第二部分 量子点免疫荧光双色标记糖尿病大鼠肾脏组织中表达的醛糖还原酶和Toll样受体428-44
• 材料与方法29-36
• 结果36-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 参考文献45-49
• 文献综述 糖尿病肾病的发病机制与靶向治疗的研究进展49-59
• 参考文献54-59
• 攻读学位期间发表论文59-60
• 致谢60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 谷娟;严谨;吴卫华;黄琪;欧阳冬生;;醛糖还原酶的研究进展[J];中南大学学报(医学版);2010年04期

2 张志华,叶玲,刘建伟,刘静;荧光法动态观察糖尿病大鼠红细胞醛糖还原酶活性[J];中国老年学杂志;2005年04期

3 李雪峰;李艳颖;贾文红;马志强;李忍萍;;α-硫辛酸治疗43例Ⅲ期糖尿病肾病患者疗效分析[J];中国慢性病预防与控制;2011年05期

4 吴茜;陈亨业;胡贝;吕哲娟;谢笔钧;孙智达;;晚期糖基化终末产物的抑制机理及抑制剂的研究进展[J];中国实用医药;2012年11期

5 陈修平;石京山;;HPLC-荧光法测定醛糖还原酶的活性[J];中国药理学通报;2012年10期

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本文编号：360120