过表达E-钙粘蛋白对TGF-β诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响

发布时间：2022-06-02 19:32

　　目的：E-钙粘蛋白（E-cadherin, E-cad）质粒（pIRES2-EGFP-ECAD）转染人腹膜间皮细胞永生化细胞株（HMrSV5）,观察E-cad的过表达对腹膜间皮细胞上皮细胞-间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）的影响。方法：（1）采用大肠杆菌DH5α进行pIRES2-EGFP-ECAD质粒及空白质粒（Vector）扩增,酶切鉴定,RT-PCR验证。（2）体外培养HMrSV5,将HMrSV5分为正常对照组、E-cad转染组、空质粒转染组,通过脂质体转染法（lip LTX）转染pIRES2-EGFP-ECAD质粒及空质粒,倒置显微镜下观察细胞形态学的变化；流式细胞术评估转染效率,采用RT-PCR、Western Blot分别观察转染后12h、24h、36h、48h、72h E-cad的mRNA及蛋白表达。（3）将HMrSV5分为正常对照组、TGF-β刺激组,采用Western Blot.细胞免疫荧光观察TGF-p刺激后12h、24h、36h、48h E-cad、 α-SMA的蛋白表达；验证iur-β刺激对HMrSV5E... 

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
1 前言
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要仪器
        2.1.2 菌株及质粒
        2.1.3 细胞株
        2.1.4 主要试剂与耗材
        2.1.5 主要配制溶液
    2.2 实验方法
        2.2.1 E.coil DH5α感受态细菌的制备
        2.2.2 连接产物转化
        2.2.3 质粒抽提
        2.2.4 质粒菌种保存
        2.2.5 抽提产物的鉴定
        2.2.6 细胞复苏和培养
        2.2.7 细胞消化传代
        2.2.8 细胞冻存
        2.2.9 细胞计数
        2.2.10 细胞转染(以E-cad质粒转染为例)
        2.2.11 实验分组
        2.2.12 荧光显微镜下观察GEFP的表达及转染率的计算
        2.2.13 流式细胞术评估转染率
        2.2.14 基因水平检测
        2.2.15 蛋白水平的检测
    2.3 统计学处理
3 实验结果
    3.1 E-cad质粒酶切电泳及RT-PCR检测结果
        3.1.1 酶切电泳鉴定结果
        3.1.2 RT-PCR检测结果
    3.2 pIRES2-EGFP-ECAD质粒转染效率评估
        3.2.1 pIRES2-EGFP-ECAD质粒转染HMrSV5后GEFP的表达情况
        3.2.2 pIRES2-EGFP-ECAD质粒转染HMrSV5后转染率统计
    3.3 pIRES2-EGFP-ECAD质粒转染HMrSV5对E-cad mRNA及蛋白的影响
    3.4 TGF-β诱导HMrSV5细胞EMT的发生
    3.5 过表达E-cad对TGF-β刺激HMrSV5细胞E-cad、α-SMA、Vimentin表达影响
4 讨论
5 结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间主要研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]E-钙黏蛋白（E-cadherin）对人滋养细胞侵袭能力及妊娠结局的影响[J]. 赵洪波,薛立荣,李大金.  生殖与避孕. 2012(01)
[2]EMT在腹膜纤维化中的作用及意义[J]. 邹莎琳,凌光辉,夏运成,袁曙光,彭佑铭,孙林,刘伏友.  中国中西医结合肾病杂志. 2009(07)
[3]腹膜透析腹膜纤维化的机制及防治[J]. 刘伏友.  中国血液净化. 2007(12)
[4]阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素[J]. 陈彦祥,乔卫红,刘栋良,李宗石.  生物工程学报. 2007(05)
[5]转化生长因子β1对人腹膜间皮细胞结缔组织生长因子的影响[J]. 张浩,刘伏友,刘映红,廖琴,龙志高,吴鼎文,敖翔,陈仙花.  中华肾脏病杂志. 2004(04)



本文编号：3652960