PPARγ抑制CKD血管钙化的作用和机制研究

发布时间：2017-05-15 03:10

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【摘要】：慢性肾脏病(CKD)在我国及全球的发病率呈逐年上升趋势,其中大部分患者最终将发展为终末期肾病(ESRD)并接受肾脏替代治疗。与普通人群相比,CKD患者心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的发生率和死亡率显著增加,而快速进展的血管钙化是此类患者CVD的重要特征和致死性心血管事件的病理基础,是CVD发病率和死亡率的独立影响因子。因此,如何阻遏CKD患者血管钙化的发生和发展具有极其重要的临床意义。正常的钙化仅发生于骨骼和牙齿,除此之外任何地方的钙化均属于异常钙化。血管钙化的主要特征就是钙磷酸盐在血管组织的病理性沉积。血管钙化可发生于血管壁的内膜和中膜,而CKD的血管钙化常见于血管中膜。血管中膜是由平滑肌细胞构成的一个结缔组织框架,血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨细胞分化是中膜钙化的主要原因。既往认为CKD血管钙化主要发生于ESRD及透析阶段,但新进研究发现CKD血管钙化最早可发生于CKD2期,而到CKD中、晚期,特别是尿毒症患者严重的矿物质代谢紊乱,高磷血症,钙、磷乘积异常则成为VSMCs向成骨细胞分化的特征性诱因。许多临床研究亦证实,高磷是CKD患者CVD和全因死亡的独立危险因素。在高磷环境中,VSMCs中钠依赖的磷酸盐转运蛋白Pit表达上调并促进细胞磷内流增加,随后激活成骨特异性转录因子——核心结合因子α1(Runx2/Cbfa1)及其下游的成骨程序,最终导致VSMCs向成骨细胞分化和钙化。虽然预防和治疗高磷血症是防治CKD血管钙化的关键,但是,即使通过限制膳食中的磷和使用非钙剂磷结合剂,CKD患者特别是透析患者仍然难以规避高磷血症对血管钙化和CVD的影响。所以,探讨高磷环境中VSMCs向成骨细胞分化的机制和防治措施是抑制CKD血管钙化的重要突破口。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是过氧化物酶体增殖物激活受体的一种亚型,主要在脂肪组织表达,可参与调控胰岛素敏感性、调节葡萄糖代谢、促进脂肪细胞分化和脂肪生成,是噻唑烷二酮类胰岛素增敏药物的作用靶点。新近研究表明,PPARγ与细胞钙磷代谢及血管钙化有着密切的关系,并对心血管系统有着重要的保护作用,且其保护作用不通过调节血糖而实现。有研究在自发性高血压大鼠中发现,其VSMCs的PPARγ表达下调,同时VSMCs表型标志物包括收缩蛋白、α-SMA和SM22α表达降低;而PPARγ激动剂却可以恢复VSMCs表性标志物的表达,抑制自发性高血压大鼠动脉重塑,这说明PPARγ是维持VSMCs表型的重要转录因子。最近,Woldt等在低密度脂蛋白受体缺陷小鼠基础上制备了PPARγ血管平滑肌细胞定点基因敲除小鼠,给予高脂饮食后发现该定点基因小鼠血管的粥样斑块中出现了软骨样细胞聚积,而对照组小鼠动脉中几乎看不到上述表现。上述这些研究提示PPARγ可以稳定VSMCs表型,拮抗血管钙化。但PPARγ是否在CKD血管钙化中扮演重要角色,其参与血管钙化的机制又是什么?目前国内外并未见研究报道。因此,本研究以CKD患者钙化血管、CKD模型小鼠、小鼠血管平滑肌细胞株(VSMCs)和Klotho基因敲除小鼠(kl/kl)为研究对象,明确PPARγ在CKD血管钙化中的关键作用;阐明高磷是否通过抑制PPARγ诱导了VSMCs向成骨细胞分化和钙化,并明确PPARγ拮抗高磷诱导血管钙化的机制;最后观察PPARγ激动是否可以抑制高磷诱导的VSMCs向成骨细胞分化和CKD血管钙化。主要研究内容和结果如下:一、PPARγ在CKD患者钙化血管中表达下调经CKD患者同意并通过伦理审查后,选取12对行肾移植手术供肾和受肾患者的肾动脉,以及37例非透析的原发性CKD5期行动静脉内瘘术患者的挠动脉用于钙化和免疫组织化学染色。冯库萨染色(Von Kossa)发现,12例肾移植受肾患者肾动脉均出现了明显的中膜钙化,钙化比例为100%(12/12)而12例供肾者的肾动脉均无钙化发生。37例CKD5期患者只有14例出现了明显的挠动脉钙化,钙化比例为37.83%(14/37),这说明CKD患者似乎更易出现大动脉血管钙化。然后我们选择钙化和无钙化的挠动脉继续进行免疫组织化学染色,结果提示,与无钙化血管相比,钙化血管PPARγ、Klotho、平滑肌22α(SM22α)的表达显著下调,而成骨细胞标志物骨形成蛋白2(BMP2)、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达则明显升高。临床检验结果分析表明,有桡动脉血管钙化的CKD5期患者血磷水平(2.16±0.52mmol/L)明显高于无血管钙化的CKD5期患者(1.60±0.54mmol/L)(P0.05),且甲状旁腺素(PTH)水平(534.63±292.77pg/ml)也明显高于无血管钙化的患者(242.01±188.74pg/ml)(P0.01),但e GFR和血钙水平并没有显著性差异。说明高磷血症、PTH水平,PPARγ表达下调均与CKD患者血管钙化有着密切的关系。二、CKD小鼠喂食高磷饮食后主动脉发生中膜钙化,并且PPARγ表达明显降低为了进一步观察PPARγ表达变化与CKD血管钙化的关系,我们用DBA/2J雌性小鼠制作CKD(单肾切除+2/3肾毁损)小鼠模型,给予高磷饮食。并将小鼠分为以下4组进行试验:假手术+正常磷饮食组(non-CKD+NP)、假手术+高磷饮食组(non-CKD+HP)、手术+正常磷饮食组(CKD+NP)、手术+高磷饮食组(CKD+HP)。从造模成功后,小鼠给予相应饮食饲养12周后取材,取小鼠血清测定尿素氮(BUN)、钙、磷含量,取主动脉进行Von Kossa染色、免疫组化、免疫荧光染色及western blot检测。结果发现CKD+HP组小鼠BUN和血磷均明显增高,并出现主动脉钙化,免疫组化、免疫荧光和western blot结果发现,与其他组比较,该组小鼠PPARγ、Klotho、SM22α表达显著降低,Runx2、BMP2表达明显增高,其他组间无显著性差异。这进一步提示PPARγ与CKD血管钙化之间存在密切关联。三、高磷可以诱导VSMCs PPARγ表达下调为了观察高磷对PPARγ表达的影响,我们分别使用含有2.6mmol/L磷酸盐的高磷培养基和磷含量正常的培养基孵育VSMCs 5天。茜素红S(Alizarin Red S)染色发现高磷的确诱导了VSMCs钙化,而western blot结果表明高磷明显降低了PPARγ、Klotho、和平滑肌细胞标志物SM22α的表达,而Runx2、BMP2蛋白表达明显增高。上述结果证实,高磷诱导VSMCs向成骨细胞分化和血管钙化的同时,下调了PPARγ的表达。四、PPARγ激动剂可以抑制高磷诱导VSMCs向成骨细胞分化和钙化为了阐明PPARγ在高磷诱导VSMCs钙化中的关键作用,我们利用PPARγ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,RGL)预孵育VSMCs 1h后,再观察高磷对VSMCs向成骨细胞分化和钙化的影响。实验分为4组:磷含量正常的对照组(NP组)、含2.6m M的高磷组(HP组)、罗格列酮组(RGL组)、高磷+罗格列酮组(HP+RGL组)。各组VSMCs细胞在高磷孵育5天后,Alizarin Red S染色观察各组细胞钙化情况,western blot检测PPARγ、SM22α、Runx2、BMP2的表达情况。结果发现RGL预孵育可以显著抑制高磷诱导的VSMCs钙化,并且RGL预孵育可以明显抑制高磷诱导的PPARγ、SM22α蛋白表达降低和Runx2、BMP2的表达增高。这说明PPARγ激动可以明显抑制高磷诱导的VSMCs向成骨细胞分化和钙化。五、Klotho基因沉默可以削弱PPARγ激动剂对高磷诱导VSMCs钙化的抑制作用虽然PPARγ激动可以抑制高磷诱导的VSMCs向成骨细胞分化和钙化,但其作用机制并不明确。研究表明Klotho是抑血管钙化因子,其已被证实在血管平滑肌细胞有表达,并通过下调磷酸盐转运蛋白1(Pit-1),阻遏细胞磷内流,从而抑制血管平滑肌细胞钙化。为此,我们拟探讨转录调控因子PPARγ是否通过调控Klotho基因转录实现了其抑制血管钙化的作用。我们首先观察了高磷预孵育对Klotho和Pit1表达的影响,再次明确高磷可以诱导VSMCs Klotho表达降低及Pit1表达升高。然后我们分4组进行研究:NP组、HP组、RGL组、HP+RGL组,荧光定量PCR检测Klotho m RNA表达,western blot检测Klotho和Pit1蛋白表达变化。结果表明,RGL预孵育可以明显抑制高磷下调Klotho表达的作用,并降低高磷诱导的Pit1表达增高。在后续研究中,我们利用Klotho si RNA敲低VSMCs Klotho表达后再次观察了PPARγ激动剂对高磷诱导VSMCs钙化的抑制作用,结果发现,Klotho si RNA干扰后再给予RGL孵育,RGL对高磷诱导VSMCs钙化和SM22α表达降低、Pit1、Runx2、BMP2表达增高的抑制作用则明显削弱。这说明PPARγ可能是通过调控其下游靶基因Klotho抑制了高磷诱导的VSMCs向成骨细胞分化和钙化。六、PPAR激动剂不能抑制高磷诱导的Klotho基因敲除(kl/kl)小鼠血管钙化为进一步证实PPARγ是否通过调控Klotho抑制了高磷诱导的血管钙化,我们以kl/kl小鼠为研究对象,观察当Klotho基因缺失时,PPARγ激动是否还可以抑制高磷诱导的血管钙化。我们采取体外直接使用高磷培养基孵育小鼠主动脉血管内膜的方法,将实验分为以下6组进行:(1)野生型小鼠主动脉血管内膜+正常磷浓度培养基组(WT+NP)、(2)野生型小鼠主动脉血管内膜+高磷培养基组(WT+HP)、(3)野生型小鼠主动脉血管内膜+正常磷浓度培养基+罗格列酮组(WT+HP+RGL)、(4)kl/kl小鼠主动脉血管内膜+正常磷浓度培养基组(kl/kl+NP)、(5)kl/kl小鼠主动脉血管内膜+高磷培养基组(kl/kl+HP)、(6)kl/kl小鼠主动脉血管内膜+高磷培养基+罗格列酮组(kl/kl+HP+RGL)。上述各组小鼠主动脉血管内膜孵育10天后,提取蛋白质并用western blot检测各组血管相关蛋白表达情况,结果表明,PPARγ激动剂可以逆转高磷诱导的野生型小鼠主动脉内膜SM22α表达降低、Runx2、BMP2表达增高,但在kl/kl小鼠主动脉血管内膜,PPARγ激动剂的上述作用则消失。这进一步明确PPARγ是通过调控Klotho抑制了高磷诱导的血管钙化。七、PPARγ激动剂可以明显改善CKD小鼠血管钙化我们利用DBA/2J雌性小鼠制作的CKD小鼠模型为研究对象,在给予高磷饮食的同时饲喂PPARγ激动剂罗格列酮。实验分为以下4组:假手术+高磷饮食组(non-CKD+HP)、手术+高磷饮食组(CKD+HP)、手术+高磷饮食+10mg/kg/d罗格列酮组(CKD+HP+10mg/kg/d RGL)、手术+高磷饮食+20mg/kg/d罗格列酮组(CKD+HP+20mg/kg/d RGL)。造模完成后给予相应饮食和RGL饲养12周后取材,取小鼠血清测定BUN、钙、磷含量,取主动脉进行Von Kossa染色、免疫组化和免疫荧光染色及western blot检测。结果发现,PPARγ激动剂罗格列酮可以显著抑制CKD小鼠的血管钙化,同时免疫组化、免疫荧光和western blot检测发现,罗格列酮喂饲可以上调CKD小鼠主动脉PPARγ、Klotho、SM22α的表达,抑制Runx2和BMP2的表达。这说明PPARγ激动剂可以明显改善CKD血管钙化。综上所述,我们的研究发现,在CKD时,高磷可能通过下调PPARγ表达,进而抑制其介导的靶基因转录,导致抑血管钙化因子Klotho表达降低,引起磷转运蛋白Pit表达增加,细胞磷摄入增多,随之启动了成骨细胞分化程序,诱导VSMCs向成骨细胞分化和血管钙化,这可能是CKD血管钙化的一个关键机制。
【关键词】：血管平滑肌细胞 高磷 钙化 PPARγ Klotho
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-12
• 中文摘要12-17
• 第一章 前言17-20
• 第二章 PPARγ参与CKD血管钙化的发生和发展20-39
• 2.1 材料和方法20-29
• 2.2 结果29-36
• 2.3 讨论36-38
• 2.4 小结38-39
• 第三章 PPARγ通过上调KLOTHO表达抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞向成骨细胞分化及血管钙化39-60
• 3.1 材料和方法39-47
• 3.2 结果47-56
• 3.3 讨论56-59
• 3.4 小结59-60
• 第四章 PPARγ激动剂对CKD血管钙化的抑制作用60-69
• 4.1 材料和方法60-63
• 4.2 结果63-66
• 4.3 讨论66-68
• 4.4 小结68-69
• 全文结论69-70
• 参考文献70-75
• 文献综述 慢性肾脏病血管钙化机制的研究75-97
• 参考文献85-97
• 攻读学位期间发表的论文97-98
• 致谢98

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  本文关键词：PPARγ抑制CKD血管钙化的作用和机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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