在一个巴基斯坦近亲结婚的家系中FANCM纯合移码突变导致男性不育的研究
发布时间：2023-04-04 00:00
精子发生包括原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)形成、迁移、增殖和分化,性原细胞增殖、静息和迁移,精原(干)细胞自我更新和分化,精母细胞减数分裂和精细胞变态形成精子一系列连续过程。其中任何一步发生异常,都会导致精子畸形、运动能力下降或数目减少(如临床上常见的畸、弱、少精子症),乃至无法形成(即临床上常见的无精子症),从而引发男性不育。男性不育影响约7%的男性。遗传因素可能是生精障碍的主要原因,但在大多数病例中,其发病病因仍不清楚。本论文对一个巴基斯坦近亲结婚后代发生男性不育的家系进行研究,以期揭示其不育的原因。父母为表兄妹结婚,生育四个儿子,其中三个不育,两位为少弱精子症患者,另一位是无精子症患者。通过全外显子组和Sanger测序,筛选到范可尼贫血(Fanconi Anemia,FA)核心复合物成分FANCM的一个移码突变(c.1946_1958del,p.P648Lfs*16)与不育症共分离,认为是该家系不育患者的潜在致病突变。因为FANCM参与DNA链间交联(interstrandcrosslink,ICL)损伤修复,所以我们检...
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 引言
1.2 精子发生
1.2.1 生殖细胞命运决定
1.2.2 原始生殖细胞迁移和存活
1.2.3 性原细胞增殖、静息和迁移
1.2.4 精原细胞自我更新和分化
1.2.5 精母细胞减数分裂
1.2.6 精子形成
1.3 范可尼贫血与DNA链间交联修复
1.3.1 范可尼贫血
1.3.2 DNA链间交联产生原因和结果
1.3.3 FA通路与链间交联修复
1.3.4 FA通路的其他作用
1.3.5 FA通路与其他修复机制的交互作用
1.4 FANCM的功能
1.4.1 FANCM在FA通路的功能
1.4.2 FANCM的独特作用
1.4.3 FANCM与Bloom综合征的关系
1.4.4 FANCM激活DNA损伤检验点而不依赖FA通路
1.4.5 FANCM在复制叉重塑中的作用
第2章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 小鼠信息
2.1.2 细胞系及菌种
2.1.3 质粒载体
2.1.4 引物序列
2.1.5 抗体信息
2.1.6 耗材及试剂
2.1.7 实验仪器
2.1.8 溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 病例收集
2.2.2 全外显子组测序
2.2.3 外周血淋巴细胞培养及染色体断裂分析
2.2.4 质粒构建
2.2.5 细胞培养及转染
2.2.6 构建FANCM-/-稳定的293T细胞系
2.2.7 外源导入FANCM回补内源FANCM敲除实验
2.2.8 免疫荧光
2.2.9 Western Blot
2.2.10 RNA抽提
2.2.11 RT-PCR
2.2.12 基因敲除小鼠制备
2.2.13 小鼠生育力检测
2.2.14 睾丸组织包埋及切片
2.2.15 组织切片苏木精伊红染色(HE)
2.2.16 组织切片免疫荧光染色
2.2.17 小鼠精母细胞铺展及染色
2.2.18 BrdU染色
2.2.19 TUNEL检测
2.2.20 精子计数
2.2.21 精原细胞中期染色体断裂分析
2.2.22 统计学分析
第3章 实验结果及讨论
3.1 实验结果
3.1.1 巴基斯坦近亲结婚家系中男性不育的临床表型
3.1.2 巴基斯坦家系不育患者中筛选并确定FANCM纯合移码突变
3.1.3 FANCM突变导致患者染色体断裂修复缺陷但不导致骨髓衰竭
3.1.4 FANCM突变功能缺失损害FA通路
3.1.5 FANCM突变降低细胞存活率
3.1.6 Fancm△C/△C
小鼠无骨髓衰竭
3.1.7 Fancm△C/△C
雄性小鼠生育力降低
3.1.8 Fancm△C/△C
雄性小鼠精子发生异常
3.1.9 Fancm△C/△C
雄性小鼠出生前后生殖细胞增殖减少
3.1.10 FANCM突变与精子变形阶段DNA断裂修复
3.2 讨论
参考文献
攻读博士期间的主要学习成果
致谢
附录1 预测突变的有害性的软件列表
本文编号：3781399
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 引言
1.2 精子发生
1.2.1 生殖细胞命运决定
1.2.2 原始生殖细胞迁移和存活
1.2.3 性原细胞增殖、静息和迁移
1.2.4 精原细胞自我更新和分化
1.2.5 精母细胞减数分裂
1.2.6 精子形成
1.3 范可尼贫血与DNA链间交联修复
1.3.1 范可尼贫血
1.3.2 DNA链间交联产生原因和结果
1.3.3 FA通路与链间交联修复
1.3.4 FA通路的其他作用
1.3.5 FA通路与其他修复机制的交互作用
1.4 FANCM的功能
1.4.1 FANCM在FA通路的功能
1.4.2 FANCM的独特作用
1.4.3 FANCM与Bloom综合征的关系
1.4.4 FANCM激活DNA损伤检验点而不依赖FA通路
1.4.5 FANCM在复制叉重塑中的作用
第2章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 小鼠信息
2.1.2 细胞系及菌种
2.1.3 质粒载体
2.1.4 引物序列
2.1.5 抗体信息
2.1.6 耗材及试剂
2.1.7 实验仪器
2.1.8 溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 病例收集
2.2.2 全外显子组测序
2.2.3 外周血淋巴细胞培养及染色体断裂分析
2.2.4 质粒构建
2.2.5 细胞培养及转染
2.2.6 构建FANCM-/-稳定的293T细胞系
2.2.7 外源导入FANCM回补内源FANCM敲除实验
2.2.8 免疫荧光
2.2.9 Western Blot
2.2.10 RNA抽提
2.2.11 RT-PCR
2.2.12 基因敲除小鼠制备
2.2.13 小鼠生育力检测
2.2.14 睾丸组织包埋及切片
2.2.15 组织切片苏木精伊红染色(HE)
2.2.16 组织切片免疫荧光染色
2.2.17 小鼠精母细胞铺展及染色
2.2.18 BrdU染色
2.2.19 TUNEL检测
2.2.20 精子计数
2.2.21 精原细胞中期染色体断裂分析
2.2.22 统计学分析
第3章 实验结果及讨论
3.1 实验结果
3.1.1 巴基斯坦近亲结婚家系中男性不育的临床表型
3.1.2 巴基斯坦家系不育患者中筛选并确定FANCM纯合移码突变
3.1.3 FANCM突变导致患者染色体断裂修复缺陷但不导致骨髓衰竭
3.1.4 FANCM突变功能缺失损害FA通路
3.1.5 FANCM突变降低细胞存活率
3.1.6 Fancm△C/△C
小鼠无骨髓衰竭
3.1.7 Fancm△C/△C
雄性小鼠生育力降低
3.1.8 Fancm△C/△C
雄性小鼠精子发生异常
3.1.9 Fancm△C/△C
雄性小鼠出生前后生殖细胞增殖减少
3.1.10 FANCM突变与精子变形阶段DNA断裂修复
3.2 讨论
参考文献
攻读博士期间的主要学习成果
致谢
附录1 预测突变的有害性的软件列表
本文编号：3781399
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/mjlw/3781399.html
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