硫酸吲哚酚对单核细胞趋化功能的影响及机制研究

发布时间：2017-05-19 18:21

  本文关键词：硫酸吲哚酚对单核细胞趋化功能的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:成人慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)发病率逐年上升,多数国家超过10%,现已成为严重影响人类健康的全球公共卫生问题。随着CKD病情进展,部分患者将进入终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD),体内大量尿毒症毒素蓄积,只能靠血液净化或肾移植维持生命。ESRD患者体内尿毒症毒素蓄积,是导致尿毒症状况的根本原因。欧洲尿毒素研究组(European uremic toxin work group,EUTox)根据这些毒素的分子量大小及蛋白结合特性将其分为小分子水溶性物质(Free water-soluble low-molecular-weight solutes)(500Da)、蛋白结合毒素(Protein-bound uremic toxins,PBUTs)和中分子物质(Middle molecules)(500Da)三类。随着透析技术的不断改进,分子量小于20k Da的化合物,即大部分的小分子水溶性毒素和中分子毒素可被有效清除。然而,以硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate,IS)为代表的PBUTs,因常与血浆中的蛋白质,尤其是与白蛋白(Human serum albumin,HSA)紧密结合而具有大分子物质的特性,现有的透析手段难以将其清除。心、脑血管事件是CKD患者的常见并发症,即便是进入了维持性血液透析治疗其发病率仍居高不下,成为导致透析患者死亡的主要原因。现有的透析技术不能清除PBUTs,提示PBUTs可能与CKD患者心、脑血管事件的高发生率有着密切联系。既往研究发现,PBUTs的典型代表IS可损伤血管内皮细胞、促进血管平滑肌细胞增殖等,使受损的血管发生炎症反应,释放单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等炎症细胞因子,MCP-1可与单核/巨噬细胞表面的CC类趋化因子受体-2(C-C chemokine receptors 2,CCR2)特异性结合,进而激活并诱导外周血中单核/巨噬细胞向炎症部位迁移、黏附、浸润,加速动脉粥样硬化的发生。可见单核/巨噬细胞在动脉粥样硬化的发病机制中起着重要作用,而这一过程需要MCP-1等炎症细胞因子及其受体的参与。既往关于PBUTs致动脉硬化的相关研究中,多集中于PBUTs损伤血管产生炎症反应,进而激活、诱导外周血中的单核/巨噬细胞向炎症部位黏附和浸润。但PBUTs可否直接作用于单核/巨噬细胞,能否通过增强单核/巨噬细胞的趋化、迁移功能而加速动脉粥样硬化等炎症相关并发症的进展,目前尚缺乏相关报道,有待于进一步研究。目的:本研究以thp-1人单核细胞作为研究对象,通过体外实验观察蛋白结合is和游离is对thp-1细胞趋化功能的影响及其可能机制,从而探讨is与ckd患者动脉粥样硬化及其他炎症相关并发症的关系。方法:1.体外配制不同浓度的蛋白结合is溶液(4%hsa+is100μmol/l,4%hsa+is200μmol/l,4%hsa+is400μmol/l,4%hsa+is800μmol/l),用30k的amiconultra-15离心过滤器超滤离心,以高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,hplc)检测超滤液中游离is的含量,分别计算出is的游离率和蛋白结合率。2.体外培养thp-1细胞,分别以不同浓度的蛋白结合is(4%hsa+is100μmol/l,4%hsa+is200μmol/l,4%hsa+is400μmol/l,4%hsa+is800μmol/l)和游离is(is100,200,400,800μmol/l)处理12、24、48h后,以cck-8法对各组单核细胞进行增殖活性检测。3.按实验分组:空白对照组(pbs平衡溶液),阴性对照组(4%hsa溶液),蛋白结合is组(4%hsa+is200μmol/l),游离is组(is200μmol/l)处理thp-1细胞,进行transwell实验,检测蛋白结合is(4%hsa+is200μmol/l)和游离is(is200μmol/l)对thp-1细胞趋化功能的影响。4.将体外培养的thp-1细胞分别以蛋白结合is(4%hsa+is200μmol/l)和游离is(is200μmol/l)处理24h,以酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoabsorbentassay,elisa)检测细胞培养上清中mcp-1的浓度。5.将体外培养的thp-1细胞分别以蛋白结合is(4%hsa+is200μmol/l)和游离is(is200μmol/l)处理24h,流式细胞术检测thp-1细胞表面ccr2的表达。结果:1.自制的不同浓度的蛋白结合is溶液(4%hsa+is100μmol/l,4%hsa+is200μmol/l,4%hsa+is400μmol/l,4%hsa+is800μmol/l)中is的游离率分别为:11.5%,12.8%,9.2%和7.85%,蛋白结合率分别为88.5%,87.2%,90.8%和92.15%。2.is对单核细胞增殖抑制作用的影响:(1)游离is对thp-1细胞的增殖具有抑制作用,随着游离is的作用浓度增加,其对thp-1细胞的增殖抑制作用逐渐增强,具有浓度依赖性(p0.05);随着游离is作用时间的延长,其对thp-1细胞的增殖抑制作用逐渐增强,具有时间依赖性(p0.05)。(2)蛋白结合is对thp-1细胞的增殖也具有抑制作用,随着蛋白结合is作用浓度的增加,其对thp-1细胞的增殖抑制作用逐渐增强,大于200μmol/L的三个浓度组与对照组比较差异有统计学意义;同时,随着蛋白结合IS作用时间的延长,其对THP-1细胞的增殖抑制作用逐渐增强,但作用24h后各时间点间无统计学差异。3.按实验分组处理THP-1细胞24h后,趋化实验结果显示:空白对照组(PBS平衡溶液)平均穿膜细胞数为(13.2±5.6)个/视野;阴性对照组(4%HSA溶液)平均穿膜细胞数为(14.5±6.4)个/视野;蛋白结合IS组(4%HSA+IS 200μmol/L溶液)平均穿膜细胞数为(85.2±26.8)个/视野;游离IS组(IS 200μmol/L溶液)平均穿膜细胞数为(123.5±48.6)个/视野。与两对照组相比,蛋白结合IS组和游离IS组趋化细胞数明显增多,具有统计学差异(P0.05);两实验组间比较,游离IS组穿膜细胞数较蛋白结合IS组穿膜细胞数明显增多,且差异具有统计学意义(P0.05)。4.按实验分组处理THP-1细胞24h,与两对照组比较,游离IS组(IS 200μmol/L)和蛋白结合IS组(4%HSA+IS 200μmol/L)MCP-1浓度明显升高,具有统计学差异(P0.05);两实验组间比较,游离IS组MCP-1浓度高于蛋白结合IS组,且差异具有统计学意义(P0.05)。5.按实验分组处理THP-1细胞24h,与两对照组比较,游离IS组CCR2表达率明显升高,差异具有统计学意义(P0.05);与阴性对照组比较,蛋白结合IS组的CCR2表达均增高,差异具有统计学意义(P0.05);游离IS组与蛋白结合IS组之间比较,前者CCR2表达率明显高于后者,具有统计学差异(P0.05)。结论:蛋白结合IS和游离IS均对单核细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度依赖性;蛋白结合IS同游离IS一样,可上调MCP-1和CCR2的表达,进而增强单核细胞的趋化功能;由于循环中蛋白结合的IS是游离IS的9倍,所以其对单核细胞趋化功能的影响更应引起高度重视;设法解离与白蛋白结合的IS,增加IS的透析清除率,对CKD患者的长期预后可能有利。
【关键词】：蛋白结合毒素 硫酸吲哚酚 单核细胞
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-24
• 结果24-33
• 讨论33-36
• 全文结论36-37
• 参考文献37-43
• 文献综述 蛋白结合尿毒素心血管毒性的研究进展43-55
• 参考文献48-55
• 攻读学位期间发表的论文55-56
• 致谢56

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本文编号：379474