肾上腺髓质素基因转染联合缺氧培养提高骨髓间充质干细胞抗凋亡能力

发布时间：2017-05-20 14:09

  本文关键词：肾上腺髓质素基因转染联合缺氧培养提高骨髓间充质干细胞抗凋亡能力，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究肾上腺髓质素(ADM)基因转染及缺氧培养对骨髓间充干细胞(BMSCs)凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响。方法:以贴壁法分离SD大鼠BMSCs。用X-gal染色测含半乳糖苷酶基因的重组腺病毒(Ad-Lac Z)对BMSCs的转染率,即含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒(Ad-ADM)对BMSCs的转染率。BMSCs缺氧培养0、3、6、9、12 h后用RT-PCR测定Bax、Bcl-2、Caspase-3 m RNA的表达;用western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达以确定最佳缺氧时间;BMSCs加入不同浓度ADM(空白组、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)缺氧6 h,RT-PCR测定Bax、Bcl-2、Caspase-3 m RNA的表达,western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达以确定最佳的ADM浓度;BMSCs分为对照组,空载体组(Ad-Lac Z组),Ad-ADM组、ADM组(100 ng/ml)。在缺氧、无血清条件下培养BMSCs,RT-PCR测定ADM及ADM受体(CRLR/RAMP-2)m RNA的表达,RT-PCR测定Bax、Bcl-2、Caspase-3 m RNA的表达;用western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达、TUNEL法测定细胞凋亡。结果:1.Ad-ADM对BMSCs的转染率与病毒感染复数(MOI)具有量效关系,MOI为150时细胞的转染率达94%。2.无血清培养条件下缺氧培养0、3、6、9、12 h后,在m RNA及蛋白水平上BMSCs表达Bax、Bcl-2相比0 h增加(P0.05),缺氧6h时Bax/Bcl-2比值达到最小(P0.05),Caspase-3表达最低(P0.05)。3.在缺氧培养基础上加入不同浓度ADM后,BMSCs在m RNA及蛋白质水平上Bax表达减少、Bcl-2表达增加、Bax/Bcl-2比值下降(P0.05),Caspase-3表达减少(P0.05)。4.在缺氧培养基础上BMSCs转染Ad-ADM后,Ad-ADM组ADM、CRLR、RAMP-2 m RNA表达增加(P0.05),在m RNA及蛋白质水平上BMSCs表达Bax减少、Bcl-2增加、Bax/Bcl-2比值下降(P0.05),Caspase-3表达减少(P0.05),细胞凋亡率下降(P0.05)。结论:1.Ad-ADM对BMSCs具有较高的转染率。2.短时间的缺氧培养(6h)可以提高BMSCs的抗凋亡能力。3.肾上腺髓质素能提高BMSCs的抗凋亡能力,并且其作用具有肾上腺髓质素浓度依赖性。4.肾上腺髓质素基因转染BMSCs后ADM、CRLR、RAMP-2的表达增加。5.肾上腺髓质素基因转染联合缺氧培养可进一步提高BMSCs的抗凋亡能力。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 肾上腺髓质素基因转染 凋亡 缺氧培养
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-6
• Abstract6-8
• 前言8-10
• 材料和方法10-30
• 1 材料10-12
• 2 方法12-30
• 2.1 骨髓间充质干细胞原代培养及传代培养12-14
• 2.2 293A细胞的复苏、培养、冻存14-16
• 2.3 携带目的基因的腺病毒的扩增、滴度测定16-18
• 2.4 携带目的基因的腺病毒对骨髓间充质干细胞转染率的测定18-20
• 2.5 RT-PCR测定各目的基因的m RNA表达20-24
• 2.6 western blot测定各蛋白的表达情况24-27
• 2.7 TUNEL法测定细胞凋亡27-29
• 2.8 统计分析29-30
• 结果30-45
• 讨论45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 综述51-57
• 参考文献55-57
• 致谢57-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 鲁玲玲;赵焕英;赵春礼;孙晓红;段春礼;杨慧;;骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年03期

2 詹以安;王共先;;骨髓间充质干细胞作为基因运载细胞在基因治疗中的应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年11期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 朱奇;慢病毒介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的实验研究[D];吉林大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 贺杰;游泳运动对大鼠心血管系统肾上腺髓质素mRNA及其受体活性修饰蛋白mRNA表达的影响[D];华东师范大学;2004年

2 王芳兵;肾上腺髓质素基因转染的骨髓间充质干细胞缺氧共培养对新生大鼠心肌细胞凋亡的影响[D];福建医科大学;2012年

3 王力涵;瘦素在缺氧预处理骨髓间充质干细胞保护心肌中的重要作用[D];浙江大学;2013年

4 张近;缺血缺氧对兔骨髓间充质干细胞的凋亡蛋白表达的影响研究[D];广西医科大学;2014年

  本文关键词：肾上腺髓质素基因转染联合缺氧培养提高骨髓间充质干细胞抗凋亡能力，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：381848