CRISPR/Cas9敲除CHD5基因促进前列腺癌细胞增殖

发布时间：2024-01-19 07:53

　　染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5, CHD5)是人类肿瘤中一个重要的抑癌基因,是肿瘤抑制网络的控制开关,但是它在前列腺癌发生发展中的作用却少有研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除前列腺癌细胞PC-3中CHD5基因,探索敲除CHD5基因对PC-3细胞增殖能力的影响。研究根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA,连接到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro质粒构建表达载体。测序鉴定后将重组表达载体转染293T细胞包装慢病毒。包装慢病毒滴度分别为CHD5-sgRNA-1 7.84×10⁹ TU/mL, CHD5-sgRNA-2 5.83×10 ⁹ TU/mL, CHD5-sgRNA-3 5.23×10⁹ TU/mL。用CHD5-sgRNA慢病毒感染PC-3细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western印迹检测CHD5蛋白的表达水平,CCK-8、克隆形成实验以及细胞周期检测对PC-3细胞...

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 CHD5基因CRISPR/Cas9 打靶位点的选择
    1.3 CRISPR/Cas9 表达载体的构建及鉴定
    1.4 慢病毒的包装与滴度测定
    1.5 慢病毒感染前列腺癌PC-3细胞
    1.6 细胞基因组DNA的提取及鉴定
    1.7 Western 印迹 检测细胞中 CHD5在蛋白质水平的表达
    1.8 CCK-8检测细胞增殖
    1.9 克隆形成能力检测
    1.10 细胞周期检测
    1.11 统计学方法
2 结果
    2.1 CRISPR/Cas9 表达载体的鉴定
    2.2 病毒滴度测定
    2.3 慢病毒CHD5-sgRNA-2和 CHD5-sgRNA-3感染PC-3细胞使CHD5蛋白表达下调
    2.4 慢病毒CHD5-sgRNA-2和 CHD5-sgRNA-3感染PC-3细胞后CHD5基因序列部分缺失
    2. 5 敲除CHD5促进前列腺癌细胞增殖
    2.6 敲除CHD5导致PC-3细胞克隆形成能力增加
    2.7 敲除CHD5诱导PC-3细胞G2/M期阻滞
    2.8 敲除CHD5 可调节G2/M相关蛋白质表达促进PC-3细胞增殖
3 讨论



本文编号：3879918