人磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型重组慢病毒载体的构建及其在人雄激素抵抗型前列腺癌PC3细胞中的表达

发布时间：2024-01-31 06:46

　　目的构建人磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(inositol polyphosphate 4-phosphatase typeⅡ,INPP4B)重组慢病毒表达载体,并检测其在人雄激素抵抗型前列腺癌细胞株PC3中的表达。方法以人工合成的人INPP4B基因为模板,PCR扩增目的基因片段,克隆入pGC-FU载体构建重组质粒pGC-FU-INPP4B,将其与辅助包装原件PHelper 1. 0和PHelper 2. 0载体经Lipofectamine TM 2000介导共转染293T细胞,包装获得携带人INPP4B基因的重组慢病毒LentiINPP4B,免疫荧光法测定病毒滴度。用Lenti-INPP4B感染PC3细胞(Lenti-INPP4B组),以慢病毒Lenti-GFP(携带GFP基因)感染的PC3细胞为阴性对照,RT-PCR及Western blot检测PC3细胞中INPP4B m RNA水平和蛋白的表达,CCK8法检测PC3细胞增殖;Western blot检测PC3细胞中p-AKT水平。结果经PCR及测序鉴定,重组质粒p GC-FU-INPP4B构建正确;Lenti-INPP4B病毒滴度达2...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞、载体、病毒及基因
    1.2 主要试剂
    1.3 人INPP4B基因的扩增
    1.4 重组质粒的构建
    1.5 慢病毒Lenti-INPP4B的包装重组及病毒滴度测定
    1.6 Lenti-INPP4B感染PC3细胞
    1.7 PC3细胞中INPP4B基因m RNA水平的检测
    1.8 PC3细胞中INPP4B蛋白表达的检测
    1.9 INPP4B表达对PC3细胞活力影响的检测
    1.1 0 INPP4B表达对PC3细胞内p-AKT水平影响的检测
    1.1 1 统计学分析
2 结果
    2.1 INPP4B目的基因扩增产物的鉴定
    2.2 重组质粒的PCR鉴定
    2.3 Lenti-INPP4B的病毒滴度
    2.4 Lenti-INPP4B病毒感染率
    2.5 PC3细胞中INPP4B基因m RNA水平
    2.6 PC3细胞中INPP4B蛋白表达
    2.7 INPP4B表达对PC3细胞活力的影响
    2.8 INPP4B表达对PC3细胞内p-AKT水平的影响
3 讨论



本文编号：3891154