腺苷信号通路在肾间质纤维化过程中的作用机制研究

发布时间：2024-02-15 21:14

　　目的：观察ADO信号通路对肾间质纤维化过程的影响。方法：(1)动物分组：共44只雄性小鼠,采取随机分组的方式,分成3个组别：其中,假手术组(Sham)12只,模型组(UUO)16只,干预组(PT)16只。干预组在单侧输尿管结扎(UUO)基础上予茶碱(8-PT)10mg/kg·d腹腔注射(1次/天),模型组在UUO基础上予生理盐水腹腔注射。于实验第1、3、7、14天分批次对小鼠进行处死操作,其中,假手术组实验小鼠,每次处死只数为3只,而模型组和干预组这两个组别的小鼠,每次处死的只数为4只。在处死前24小时将小鼠置入代谢笼内收集24小时尿测定尿肌酐(UCr)、β2微球蛋白(β2-MG)含量；处死前1.5小时通过小鼠阴茎静脉注射低氧探针Hypoxy probe-1(60mg/kg)。小鼠处死后,留取进行了结扎处理一侧的肾组织,开展后续的形态学以及免疫组织化学两个方面的研究。(2)观察指标：通过对肾组织进行HE以及Masson染色处理后,观察三个不同实验组的小鼠肾组织中肾小管受损的程度、肾间质中炎性细胞的侵润状况以及肾间质纤维化程度；运用免疫组织化学技术观察实验对象的肾小管上皮细胞和间质细胞的...

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摘要
Abstract
符号说明
前言
第一章 腺苷通路诱导肾间质纤维化的形态学研究
    1 材料和方法
        1.1 动物来源
        1.2 主要试剂与溶液配置
            1.2.1 免疫组织化学试剂
            1.2.2 主要溶液配置
        1.3 主要仪器
        1.4 实验方法
            1.4.1 动物模型制备及分组
            1.4.2 肾组织标本的处理流程
            1.4.3 HE染色步骤
            1.4.4 Masson's的三色染色流程
            1.4.5 免疫组织化学方法的运用和具体的实施步骤
        1.5 指标观察及定量分析
            1.5.1 小鼠肾小管损伤程度评分
            1.5.2 小鼠肾间质纤维化程度判断
            1.5.3 肾小管和肾间质PCNA阳性表达率
            1.5.4 肾组织缺氧程度的半定量化测定
        1.6 肾组织腺苷浓度的测定
            1.6.1 色谱条件
            1.6.2 腺嘌呤核苷酸的提取
            1.6.3 样品的测定和数据分析
        1.7 小鼠肾功能测定
            1.7.1 标本收集
            1.7.2 尿肌酐(UCr)、β₂微球蛋白(β₂-MG)含量,采用中南大学湘雅三医院检验科全自动生化分析仪一次性检测
        1.8 统计学处理
    2 结果
        2.1 肾组织腺苷浓度的升高导致小鼠肾间质纤维化
        2.2 茶碱能减轻肾组织纤维化程度,对肾组织具有保护作用
    3 讨论
第二章 腺苷通路导致肾间质纤维化的分子机制研究
    1. 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 动物来源
            1.1.2 主要的实验试剂
            1.1.3 主要溶液配置
            1.1.4 引物设计和合成处理
            1.1.5 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 动物模型制备和分组
            1.2.2 肾组织总RNA抽提及鉴定
            1.2.3 对于基因组中DNA进行去除处理
            1.2.4 逆转录(RT)反应(20μl体系)
            1.2.5 Real time PCR(25μl体系)
            1.2.6 Real time PCR结果判断
            1.2.7 肾组织形态学的检测流程
            1.2.8 免疫组织化学方法及步骤
            1.2.9 TGF-β₁、α-SMA免疫组化定量分析
        1.3 统计学处理
    2 结果
        2.1 促纤维化因子TGF-β₁、PAI-1、α₁(Ⅰ)procollagen mRNA在RIF小鼠肾组织中的动态变化以及不同浓度的ADO对该变化的影响
            2.1.1 TGF-β₁ mRNA在肾脏出现纤维化病变过程中的表达规律以及阻断ADO信号通路对TGF-β₁ mRNA的影响
            2.1.2 PAI-1 mRNA在肾脏出现纤维化病变过程中的表达规律以及阻断ADO信号通路对PAI-1 mRNA的影响
            2.1.3 a,(I)procollagen mRNA在肾脏出现纤维化病变过程中的表达规律以及阻断ADO信号通路对a 1 ( I ) procol lagen mRNA的影响
        2.2 各实验组TGF-β₁、α-SMA在肾组织中的表达及分布规律
            2.2.1 各实验组TGF-β₁在肾组织中的表达及分布规律
            2.2.2 各实验组α-SMA在肾组织中的表达及分布规律
    3 讨论
第三章 腺苷通路对肾成纤维细胞生物学行为的影响
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 细胞来源
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 主要仪器
        1.2 方法与步骤
            1.2.1 PCR反应引物
            1.2.2 RNA提取步骤
            1.2.3 基因组DNA的去除步骤
            1.2.4 逆转录(20μl体系)反应
            1.2.5 Real-time PCR(25μl体系)实时荧光法
            1.2.6 Real-Time PCR(50μl体系)TaqMan探针法
            1.2.7 Real-time PCR扩增程序
            1.2.8 不同的药物对成纤维细胞的处理及分组
            1.2.9 MTT方法检测细胞毒性(生长曲线)
        1.3 统计学处理
    2 结果
        2.1 肾成纤维细胞表面腺苷受体的表达
        2.2 不同处理条件下肾成纤维细胞表达促纤维化因子TGF-β₁、α₁(Ⅰ)procollagenmRNA以及α-SMA mRNA的变化
            2.2.1 TGF-β₁ mRNA在不同药物干预下的表达规律
            2.2.2 α₁(Ⅰ)procollagen mRNA在不同药物干预下的表达规律
            2.2.3 α-SMA mRNA在不同药物干预下的表达规律
        2.3 不同干预条件对肾成纤维细胞增殖的影响
    3 讨论
总结
展望
参考文献
综述
攻读学位期间主要的研究成果
致谢



本文编号：3900254