动力相关蛋白-1在缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用

发布时间：2017-06-01 06:21

  本文关键词：动力相关蛋白-1在缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)发病率高、死亡率也高,对一些重症AKI尚缺乏有效的治疗方法[1]。线粒体是细胞代谢的主要能量来源,也是调节细胞死亡的重要细胞器。细胞损伤或缺氧时,可通过激活Caspase系统或ROS的释放,启动不同类型的细胞死亡[2]。致病因素导致肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,进而激活多种细胞死亡通路,可能是AKI发生发展的重要机制。新近研究表明,焦亡是AKI时肾小管上皮细胞死亡的主要方式,但目前对其发生机制及信号通路知之甚少。我们前期研究发现Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(ACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,Nlrp3)在AKI发病机制中发挥着重要作用,并在肾小管上皮细胞焦亡发生中扮演关键角色,但其上游调控通路及其机制尚不清楚。目前研究显示线粒体功能障碍在Nlrp3激活中起到了中枢作用,而动力相关蛋白-1(dynamin-related protein 1,Drp1)是线粒体分裂的关键“分子开关”,参与了线粒体功能障碍的发生发展[3]。最新研究显示RNA病毒可通过Drp1介导Nlrp3的激活[4]。但是Drp1、线粒体功能障碍和Nlrp3三者之间的相互关系及调控机制尚不明了。基于上述背景,我们提出Drp1通过调控线粒体/Nlrp3轴进而介导AKI中肾小管上皮细胞焦亡的假设。本项目首先验证急性肾损伤中肾上皮细胞的焦亡效应,再通过分别干预Drp1,线粒体/Nlrp3轴,以研究Drp1、线粒体及炎症体分子之间的相互作用及调控机制,为阐释AKI中肾小管上皮细胞焦亡的发生机制,寻找AKI治疗的新靶点提供新思路。研究内容本研究拟采用缺氧复氧(H/R)措施处理人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),以模拟HK-2细胞缺血再灌注损伤,并检测被处理细胞的炎性因子IL-1?以及caspase-1蛋白表达水平及肾小管上皮细胞焦亡情况,探讨缺血再灌注(I/R)后人肾小管上皮细胞炎症及焦亡反应状态,并检测HK-2细胞中Nlrp3炎性体、活性氧ROS、Drp1的表达,探讨I/R导致HK-2细胞炎性因子IL-1?活化及焦亡的可能机制。同时使用Mdivi-1阻断Drp1的活性,再检测H/R的HK-2细胞中Drp1、Nlrp3炎性体表达变化,同时对H/R的HK-2细胞炎性因子IL-1?表达水平、活性氧ROS、肾小管上皮细胞焦亡及焦亡相关分子表达进行检测,研究Drp1在炎症及焦亡反应中的作用及其可能机制。研究步骤1.体外扩增si Nlrp3腺病毒,计算病毒滴度和MOI值,供后续试验。2.体外培养人肾小管上皮细胞,用缺氧复氧条件模拟人肾小管上皮细胞缺血再灌注模型。3.用流式细胞仪观察各组细胞焦亡的情况。4.采用Beckman AU5800全自动生化分析仪对各组细胞上清中乳酸脱氢酶的水平进行检测。5.激光共聚焦观察各组细胞活性氧的表达水平。6.采用Western blot法对Nlrp3、caspase-1、Drp1、IL-1?蛋白在各组细胞中的表达进行检测。实验结果1.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞发生了细胞焦亡。(1)正常对照组:细胞培养上清液中乳酸脱氢酶LDH为36.90±1.89 IU/L,流式细胞仪检测显示,正常对照组细胞焦亡率仅为0.115%。(2)缺氧/复氧(H/R)组:缺氧复氧24h后,细胞上清液中焦亡相关分子乳酸脱氢酶显著升高达58.80±6.58 IU/L,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05);人肾小管上皮细胞焦亡率增多至5.27%,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),说明缺氧复氧能显著增加人肾小管上皮细胞的焦亡。2.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞Nlrp3炎性体、IL-1β、caspase-1水平升高,沉默Nlrp3能减少Nlrp3炎性体、IL-1β、caspase-1表达水平,同时降低人肾小管上皮细胞焦亡率。(1)正常对照组:人肾小管上皮细胞中Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平较低。(2)缺氧/复氧(H/R)组:与正常对照组相比,缺氧复氧24h后,人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化增加,炎性因子IL-1β水平显著升高(P0.05)。(3)缺氧/复氧+Nlrp3沉默腺病毒(H/R+si Nlrp3)组:与缺氧/复氧(H/R)组相比,缺氧复氧24h后,人肾小管上皮细胞焦亡升高程度(1.78%)显著低于缺氧/复氧组(5.27%)(P0.05),人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化减少,炎性因子IL-1β水平显著降低(P0.05),表明si Nlrp3腺病毒能有效地减轻缺氧复氧诱导的人肾小管上皮细胞焦亡,Nlrp3参与了缺氧复氧导致的人肾小管上皮细胞焦亡。3.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞中Drp1、ROS表达上调,Mdivi-1能抑制Drp1活化,减少ROS表达,同时降低Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平,并减少细胞焦亡。(1)正常对照组:人肾小管上皮细胞中Drp1、ROS水平较低。(2)缺氧/复氧(H/R)组:与正常组相比,缺氧复氧24h后,人肾小管上皮细胞Drp1表达显著上调(P0.05),细胞中活性氧表达也显著升高。(3)缺氧/复氧+Mdivi-1(H/R+Mdivi-1)组:缺氧/复氧(H/R)组,Mdivi-1未能明显降低Drp1表达,但细胞中活性氧的表达显著降低,人肾小管上皮细胞焦亡升高程度(1.8%)显著低于缺氧/复氧组(5.27%)(P0.05),人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化减少,炎性因子IL-1β水平显著降低(P0.05),提示抑制Drp1活化能有效减低细胞活性氧水平,降低人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1表达,Drp1参与了缺氧复氧诱导的人肾小管上皮细胞焦亡。结论1.细胞焦亡是缺氧/复氧诱导肾小管上皮细胞死亡的重要方式。2.缺氧/复氧通过上调Drp1,诱导Nlrp3炎性体表达和线粒体功能障碍,进而导致人肾小管上皮细胞发生炎症反应和焦亡,是急性缺血性肾损伤的重要发生机制。
【关键词】：动力相关蛋白1 Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3 细胞焦亡 人肾小管上皮细胞 缺氧/复氧损伤
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 缺氧/复氧诱导人肾小管上皮Drp1、Nlrp3、活性氧、IL-1β 过表达致细胞焦亡15-31
• 2.1 材料与方法15-23
• 2.2 实验结果23-29
• 2.3 讨论29-31
• 第三章 抑制Drp1激活对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡的影响31-40
• 3.1 材料与方法31-37
• 3.2 实验结果37-38
• 3.3 讨论38-40
• 全文结论40-41
• 参考文献41-43
• 文献综述 线粒体功能障碍与焦亡在急性肾损伤中的相关研究及展望43-51
• 参考文献48-51
• 硕士期间发表论文目录51-52
• 致谢52

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 马尔丽,曾智,张杰,黄明惠,强欧;缺氧复氧对内皮细胞间隙连接通讯功能的影响初探[J];华西医科大学学报;2002年03期

2 马尔丽,曾智,李小丽,张庆,陈玉成,张杰,黄明惠,强欧;酪氨酸蛋白激酶抑制剂对缺氧复氧时内皮细胞连接通讯功能的影响[J];心血管康复医学杂志;2003年05期

3 杨红,张文健,吴练秋,顾锋,叶丽亚,李静,许世清,徐亚平,娄晋宁;α-1抗胰蛋白酶对肝窦内皮细胞缺氧复氧损伤保护作用的实验研究[J];中华医学杂志;2005年02期

4 郑杨;佟倩;张文杰;张朝普;田志广;;福辛普利对缺氧复氧豚鼠心室肌细胞动作电位及其离子通道的影响[J];中国药学杂志;2007年19期

5 张珂;王芹;仇大海;于灵芝;;缺氧复氧对大鼠神经细胞凋亡的影响[J];山东医药;2008年13期

6 张春燕;刘友平;杨烨;龚舒;李洪;;缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞蛋白质组表达变化的初步研究[J];中国病理生理杂志;2010年05期

7 朱启伟;王浩;张今尧;叶平;骆雷鸣;;吡格列酮对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用及对蛋白激酶C表达的影响[J];南方医科大学学报;2011年11期

8 周贻军;赵亚男;赵鑫;缪绯;王先宝;颜竞;张秀丽;刘映峰;杨平珍;;缺氧后适应与心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧的保护作用及机制探讨[J];山东医药;2013年44期

9 解欣然;张蕾;尚菊菊;林燕;张璐;刘红旭;;参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响[J];中华中医药杂志;2012年03期

10 史成和;陆松敏;刘建仓;张雅琳;张莲萍;凌云;;紫芪方对缺氧复氧所致大鼠小肠上皮细胞损伤的保护作用[J];中华创伤杂志;2006年10期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 袁志强;彭毅志;李晓鲁;黄跃生;杨宗城;;HSP70基因转染对肠上皮细胞缺氧/复氧后线粒体能量代谢的影响[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

2 朱启伟;王浩;张今尧;叶平;骆雷鸣;;吡格列酮对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用及对蛋白激酶C表达影响的研究[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年

3 赵舒武;汪涛;王晓玲;卢斌;;补阳还五汤载药血清对缺氧复氧神经干细胞的抗氧化能力及Nrf2 mRNA表达的影响[A];中国解剖学会2013年年会论文文摘汇编[C];2013年

4 鲁向辉;迟路湘;刘恺鸣;;辛伐他汀对缺氧复氧后大鼠脑微血管内皮细胞MMP-9表达及通透性的影响[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

5 刘英;张贺鸣;冯国清;;巴戟天对培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的防护作用[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年

6 侯金才;刘建勋;张鹏;韩笑;李丹;王秀辉;;黄芩苷对缺氧复氧小胶质细胞TLR4通路的影响[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年

7 袁志强;李晓鲁;彭毅志;王裴;黄跃生;杨宗城;;HSP70对肠上皮细胞缺氧/复氧后线粒体能量代谢的影响[A];第八届西南五省一市烧伤整形学术会议暨贵州省医学会烧伤整形分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年

8 张峰;梅其炳;;一氧化氮预处理对心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的信号通路及机制[A];2003全国中青年药理学英文学术报告会论文摘要汇编[C];2003年

9 张艳美;石刚刚;;碘化N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧大鼠心肌细胞Egr-1表达的影响及心肌损伤的保护作用[A];第九届全国心血管药理学术会议论文集[C];2007年

10 陈铁龙;王建安;石恒;桂春;骆荣华;谢小洁;;环孢菌素A减少缺氧复氧诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用和机制研究[A];2007年浙江省心电生理与起搏学术年会论文汇编[C];2007年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 周苏宁;洛伐他汀对缺氧复氧心肌细胞保护作用的研究[D];山东大学;2004年

2 周燕琼;碘化N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧大鼠心脏微血管内皮细胞Egr-1表达及细胞损伤的影响[D];汕头大学;2008年

3 王桂斌;依达拉奉对缺氧复氧酸中毒损伤神经元的保护作用及机制研究[D];中南大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 魏祺;缺氧诱导因子-1α与缺氧复氧条件下NLRP3炎症小体激活的关系[D];南昌大学医学院;2015年

2 任翔;黄芩苷对肠上皮细胞缺氧复氧损伤后屏障功能的影响[D];滨州医学院;2015年

3 陈雨;动力相关蛋白-1在缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用[D];第三军医大学;2016年

4 孙爱萍;冷诱导RNA结合蛋白在缺氧复氧损伤中的心肌保护作用研究[D];南昌大学;2014年

5 杨富国;黄芪注射液对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤保护作用的实验研究[D];青岛大学;2003年

6 杨天潇;促红细胞生成素对缺氧复氧心肌细胞的保护作用及其机制[D];南方医科大学;2014年

7 汤劐菱;参附注射液对缺氧复氧损伤心肌的保护作用及分子机制研究[D];四川大学;2004年

8 安英男;前列地尔对兔主动脉内皮细胞缺氧复氧损伤后抗栓功能的影响[D];辽宁医学院;2011年

9 苏晓乐;肾上腺髓质素（ADM）对缺氧复氧诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制[D];山西医科大学;2011年

10 邹璐;肾素前体受体通过P38 MAPKs影响缺氧复氧诱导的炎症因子变化[D];大连医科大学;2014年

  本文关键词：动力相关蛋白-1在缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：411917