PHD锌指蛋白14在肾间质纤维化中的作用及机制研究

发布时间：2017-06-03 20:14

  本文关键词：PHD锌指蛋白14在肾间质纤维化中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:研究在急性损伤后肾纤维化过程中,肾组织PHD锌指蛋白14(PHF14)的表达变化规律和该PHF14在急性损伤后肾纤维化中的作用,并对其可能机制进行探究。方法:1.建立小鼠叶酸性肾病模型,利用Masson染色病理切片和collagen 1、alpha-SMA免疫组化染色验证模型制作成功。以实时PCR技术与免疫印迹技术检测PHF14蛋白在肾脏处于急性损伤和后续纤维化进展状态下的表达规律。2.杂交培育PHF14条件敲除小鼠,再应用他莫昔芬实施PHF14敲除并验证敲除成功。3.给予PHF14敲除成功小鼠和未经PHF14敲除小鼠叶酸刺激,利用免疫印迹技术,Masson染色病理切片和collagen 1、alpha-SMA免疫组化染色比较PHF14敲除组与PHF14非敲除组纤维化程度。4.以实时PCR技术与免疫印迹技术和免疫荧光技术检测经TGF-beta刺激的大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)的PHF14表达变化规律。5.在TGF-beta刺激NRK-49F之前采用smad2/3磷酸化抑制剂SB431542抑制smad2/3磷酸化后以实时PCR技术、免疫印迹技术检测PHF14表达变化规律是否与未加抑制剂前相同。并采用染色质免疫共沉淀技术验证smad2/3与PHF14启动子区是否有结合位点。6.应用PHF14的siRNA干扰NRK-49F的PHF14表达后采用免疫印迹和免疫荧光技术检测纤维化指标collagen 1和alpha-SMA表达情况。7.PHF14 siRNA干扰NRK-49F组和随机RNA干扰NRK-49F组分别以实时PCR和免疫印迹技术检测PDGFR-alpha的表达。并且采用染色质免疫共沉淀技术验证前人研究结果中PHF14结合于PDGFR-alpha启动子位置。结果:1.肾脏受到叶酸的促纤维化刺激后PHF14表达在mRNA水平上和蛋白水平上都持续增加,通过杂交成功培育了PHF14诱导敲除小鼠。在小鼠成年后使用他莫昔芬诱导PHF14敲除不能造成胚胎期即敲除PHF14小鼠的广泛纤维化表型,也不会致死。成年小鼠在诱导PHF14敲除后遭受叶酸刺激的慢性纤维化期其肾脏纤维化程度会更加严重。2.在细胞水平上,TGF-beta刺激可以上调NRK-49F细胞PHF14的表达,其机制是通过TGF-beta/p-smad3直接启动PHF14的转录。而PHF14又能和其他蛋白构成复合体以相同的方式直接抑制PDGFR-alpha的转录。结论:在叶酸性肾病中,PHF14蛋白表达随着纤维化程度进展持续上调。PHF14的高表达是由TGF-beta/p-smad3介导的。上调的PHF14能抑制纤维化的进展,其机制是通过抑制PDGFR-alpha的转录。TGF-beta/p-smad3/PHF14通路可被视作TGF-beta所主导的肾促纤维化信号通路的自限性机制和促纤维化-抑制纤维化再平衡通路。
【关键词】：PHF14 肾纤维化 TGF-beta 间质成纤维细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略词表9-11
• 前言11-12
• 第一部分 叶酸性肾病小鼠模型中PHF14的表达规律及其对纤维化进展的作用12-32
• 前言12-13
• 实验设计13-15
• 材料与方法15-25
• 结果25-30
• 讨论30-32
• 第二部分 TGF-BETA刺激成纤维细胞时PHF14的表达变化及其在成纤维细胞活化过程中的作用32-50
• 前言32-33
• 实验设计33-35
• 材料与方法35-42
• 结果42-48
• 讨论48-50
• 全文总结50-51
• 参考文献51-54
• 综述 TGF-beta 在肾纤维化中的作用54-59
• 参考文献56-59
• 在读期间完成和发表的文章59-60
• 致谢60

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本文编号：419132