系膜细胞中TIMP-1调控单核细胞趋化因子CCL2和分化因子PAQRB的机制研究

发布时间：2017-07-03 14:07

  本文关键词：系膜细胞中TIMP-1调控单核细胞趋化因子CCL2和分化因子PAQRB的机制研究

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【摘要】：背景：系膜增殖性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MesPGN)是根据病理学形态来定义的疾病,包括IgA肾病和非IgA肾病。系膜增殖性肾炎经典的动物模型是抗Thy-1肾炎模型,分为系膜溶解期,系膜增殖期,系膜增殖恢复期。细胞基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitors of Metalloproteinases, TIMPs)是基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)的内源性抑制剂,它作为细胞因子发挥非MMPs依赖的对细胞因子进行调控。前期工作中,大鼠抗Thy-1肾炎模型基因芯片检测结果显示,TIMP-1和细胞因子C-C chemokine ligand 2 (CCL2)的表达水平在系膜溶解期开始上调,系膜增殖期达到高峰,在增殖恢复期又逐渐降低。CCL2是将单核巨噬细胞募集至炎症部位的细胞因子,NF-κB作为重要的转录因子,能够促进CCL2在多种细胞的表达。因此我们推断TIMP-1可能通过NF-κB介导CCL2上调,从而调控系膜溶解期和系膜增殖期的免疫炎症反应。单核巨噬细胞分化因子(Monocyte to macrophage differentiation-associated, MMD)王要由MMD基因(PAQRB基因)编码,主要功能为诱导单核细胞向巨噬细胞的分化。我们推断在系膜增殖性肾小球肾炎中,TIMP-1通过NF-κB上调CCL2的表达,促进单核细胞在炎症部位的募集,并通过促进PAQRB的表达,将单核细胞分化为单核巨噬细胞,参与免疫炎症反应的发生发展。目的：利用Taqman探针技术验证TIMP-1和CCL2在大鼠抗Thy-1肾炎中的表达水平变化；利用Taqman探针法和蛋白质印迹法(Western Blot)检测TIMP-1对细胞因子CCL2的调控作用；阻断高表达系膜细胞模型中NF-κB的水平并验证下游CCL2的表达变化；利用转录组测序技术(RNA-seq)得到TIMP-1高表达时的下游差异基因表达谱；利用Taqman探针法验证下游差异基因PAQRB的mRNA表达水平。方法：(1)制备大鼠抗Thy-1肾炎模型,分别在第0天(对照组)、第1天、第3天、第4天、第5天、第7天(均为模型组)处死大鼠,研磨得到肾小球。利用Taqman探针法检测TIMP-1和CCL2在抗Thy-1肾炎各个时间点的表达水平。(2)利用体外细胞实验建立TIMP-1高表达与低表达的大鼠系膜细胞(RMC)模型。利用GFP-TIMP-1慢病毒转染RMC的方法建立高表达模型,并于第3天起观察细胞荧光表达；设计TIMP-1小干扰RNA序列并利用脂质体转染技术构建低表达模型。(3)收集TIMP-1高表达RMC模型第6天的细胞和TIMP-1氏表达模型中第48小时的细胞,利用Taqman法和蛋白印迹法(Werstern blot)检测TIMP-1, MMP2, MMP9, NF-κB和CCL2的mRNA和蛋白表达水平。(4)在TIMP-1高表达系膜细胞模型第4天加入NF-kB阻断剂BAY11-7082 (5μmol/L),培育48小时后,提取细胞RNA。利用Taqman探针法检测CCL2的mRNA表达水平变化。(5)对TIMP-1高表达系膜细胞进行转录组测序,得到差异基因表达谱,利用生物信息学分析关键基因PAQRB的作用。(6)利用RT-PCR去验证PAQRB在TIMP-1高表达与低表达模型中的表达。结果：(1)在大鼠抗Thy-1肾炎模型中,TIMP-1和CCL2的表达水平呈现先升高再恢复正常的趋势,其中TIMP-1在第3天,第5天和第7天升高明显,第5天达到峰值。CCL2在第2天达到峰值。(2)成功建立TIMP-1高表达与低表达的大鼠系膜细胞模型。转染后表达荧光的效率达90%。(3)TIMP-1表达升高时,MMP9,NF-κB和CCL2的表达显著升高(P0.05)；反之当TIMP-1表达降低时,MMP9,NF-κB和CCL2表达显著降低(P0.05)。MMP2的变化则不明显。(4)当阻断NF-κB48小时后,TIMP-1高表达系膜细胞模型中CCL2明显降低(P0.05)。(5)TIMP-1调控许多与细胞增殖／凋亡、细胞分化、免疫炎症信号转导等相关的蛋白,参与系膜增殖性肾小球肾炎的免疫炎症反应。TIMP-1表达上调促进单核巨噬细胞分化因子(PAQRB)的分泌,后者促进单核细胞的分化。(6)TIMP-1表达升高时,PAQRB的表达显著升高(P0.05)；反之当TIMP-1表达降低时,PAQRB表达显著降低(P0.05)。结论：在大鼠系膜细胞中,TIMP-1可以通过激活NF-κB信号通路调控单核细胞趋化因子CCL2,促进单核巨噬细胞分化因子PAQRB的分泌,参与系膜增殖性肾小球肾炎的免疫炎症反应。
【关键词】：系膜增殖性肾小球肾炎 TIMP-1 NF-κB CCL2 PAQRB
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.31
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一部分：TIMP-1和CCL2在大鼠抗Thy-1肾炎中的表达11-23
• 前言11-13
• 第一节 大鼠抗Thy-1肾炎模型的建立13-19
• —、材料与方法13-16
• 二、结果16-17
• 三、讨论17
• 四、结论17-19
• 第二节 大鼠抗Thy-1肾炎模型中TIMP-1和CCL2的表达19-23
• 一、材料与方法19-21
• 二、结果21-22
• 三、讨论22
• 四、结论22-23
• 第二部分 TIMP-1调控NF-κB-CCL2通路和PAQRB的机制研究23-53
• 前言23-25
• 第一节 TIMP-1不同表达水平系膜细胞模型的建立25-31
• —、材料与方法25-27
• 二、结果27-29
• 三、讨论29
• 四、结论29-31
• 第二节 TIMP-1调控NF-κB-CCL2通路的作用机制研究31-41
• 一、材料与方法31-34
• 二、结果34-37
• 三、讨论37-39
• 四、结论39-41
• 第三节 TIMP-1调控单核巨噬细胞分化因子PAQRB的研究41-53
• 一、材料与方法41-43
• 二、结果43-48
• 三、讨论48-51
• 四、结论51-53
• 全文总结53-55
• 参考文献55-61
• 文献综述61-75
• 参考文献70-75
• 攻读硕士学位期间发表论文75-76
• 致谢76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郑玉玲;田力;;基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA慢病毒表达载体的构建与鉴定[J];世界中西医结合杂志;2007年06期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 吕杨;抗Thy-1肾炎模型基因表达谱和蛋白质表达谱研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年

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本文编号：513918