HVJ-E致PC3细胞凋亡的作用机制

发布时间：2017-07-06 12:10

  本文关键词：HVJ-E致PC3细胞凋亡的作用机制

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【摘要】：前列腺癌是最常见的恶性肿瘤。在美国,前列腺癌是引起男性死亡率第二高的癌症。前列腺癌发展缓慢,它是雄激素依赖性生长肿瘤。雄激素阻断后,前列腺癌会出现消退。后来出现了激素抵抗型癌细胞株,可抵抗常规治疗手段并最终导致死亡。因此,开展新型的治疗方法来治疗激素抵抗型前列腺癌尤为重要。研究表明,灭活仙台病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope, HV J-E)不仅可以作为载体传递抗肿瘤药物,激活多重抗肿瘤免疫,同时还能直接杀伤肿瘤。本研究中,我们使用HVJ-E来诱导人前列腺癌细胞产生凋亡及自噬,并初步探讨了其可能的作用机制。首先,我们用HVJ-E处理PC3细胞,倒置显微镜下观察发现,细胞出现生长停滞、皱缩和破裂的现象,FACS检测显示,经HVJ-E处理后,PC3细胞均产生明显的凋亡,且呈剂量依赖关系,提示HVJ-E可直接导致PC3细胞凋亡。为探讨HVJ-E致PC3细胞凋亡的作用机制,我们用Western Blot法检测了Caspase信号通路的相关蛋白,结果表明,随着HVJ-E浓度的升高,caspase-9、caspase-3、PARP均被有效激活。为进一步验证caspase通路在HVJ-E致PC3细胞凋亡中的作用,我们以广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞后再用HVJ-E处理,结果显示,caspase-3的活化被显著抑制,同时FACS检测结果也表明,Z-VAD-FMK可显著抑制HVJ-E诱导的凋亡率。为进一步探究HVJ-E致PC3细胞凋亡的作用机制,我们以Western Blot法检测了MAPK信号通路中的3个主要亚族,结果表明p38、JNK和Erkl/2均被激活。为进一步确认MAPK通路在HVJ-E致PC3细胞凋亡中的作用,我们分别利用p38抑制剂SB203580(10μM)、JNK抑制剂SP600125 (7.5μM)、Erk1/2抑制剂U0126 (20μM)预处理细胞30分钟后,再以HVJ-E处理PC3细胞,Western Blot结果显示,p38、JNK和Erk1/2的激活均被显著抑制。同时,FACS和CCK-8的检测结果也表明,各抑制剂可下调HVJ-E诱导的细胞凋亡,并减少HVJ-E导致的细胞死亡,证实了MAPK在HVJ-E诱导的PC3细胞凋亡中发挥重要作用。为深入探明HVJ-E激活MAPK信号通路的可能机制,我们测定了HVJ-E处理PC3细胞后活性氧(ROS)的产生水平,结果显示,随着HVJ-E浓度的升高,PC3产生ROS的水平也升高,说明HVJ-E可刺激细胞产生ROS。为研究ROS在HVJ-E激活MAPK通路中的作用,我们以活性氧清除剂(NAC)预处理PC3细胞30分钟,然后加入HVJ-E作用24小时。再经FACS法检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示,NAC能抑制HVJ-E诱导的凋亡率；同时,NAC能抑制MAPK信号通路中JNK、Erkl/2、P38蛋白的磷酸化,提示ROS可能是HVJ-E激活MAPK信号通路,并最终导致PC3细胞凋亡的主要因素。自噬在细胞死亡中发挥重要作用,为研究HVJ-E是否可引起PC3细胞自噬,我们利用GFP-LC3质粒转染PC3细胞,观察自噬小体,并通过LC3I/II的转化计算,证实HVJ-E可诱导PC3细胞自噬。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路对自噬为负调控,而III型PI3K/becline-1则对自噬形成正调控,Western Blot结果显示,经HVJ-E处理后,AKT、mTOR、p70S6K被激活,同时Becline-1的表达也随着HVJ-E的处理而增强。由此说明PI3K/Becline-1参与了HVJ-E引起的细胞自噬。为进一步研究自噬在HVJ-E致PC3细胞凋亡中的作用,我们分别利用自噬诱导剂Rapa和自噬抑制剂CQ分别预处理PC3细胞,然后再以HVJ-E进行刺激,FACS和CCK-8结果表明,RAPA可提高HVJ-E致PC3细胞的凋亡率(p0.01),而CQ对HVJ-E致PC3细胞凋亡率没有影响(p0.05); Western Blot检测结果显示,与HVJ-E组对照组相比,HVJ-E+Rapa组可进一步提高JNK、Erk1/2和p38的磷酸化水平,并促进caspase-3的裂解,提示促进自噬,可提高HVJ-E引起的PC3细胞凋亡率,这也为研究HVJ-E致肿瘤细胞凋亡的研究提供了新的借鉴。
【关键词】：灭活仙台病毒 PC3 凋亡 自噬
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符号说明10-11
• 文献综述11-20
• 1 仙台病毒基本概述12-14
• 1.1 仙台病毒的形态结构12
• 1.2 仙台病毒的分子生物学特征12-13
• 1.3 仙台病毒生物学功能发挥方式13
• 1.4 仙台病毒调节免疫应答13-14
• 1.5 仙台病毒研究展望14
• 2 细胞凋亡14-17
• 2.1 细胞凋亡的分子机理14
• 2.2 细胞凋亡的特征14-17
• 3 细胞自噬17-20
• 3.1 自噬的形成17
• 3.2 自噬的分类17-18
• 3.2.1 巨自噬18
• 3.2.2 分子伴侣介导的自噬18
• 3.2.3 微自噬18
• 3.3 自噬在肿瘤中的作用18-20
• 3.3.1 自噬的两面性18-19
• 3.3.2 自噬的免疫研究19-20
• 第一部分 HVJ-E致PC3凋亡的作用机制20-37
• 1 材料20-21
• 1.1 细胞株、病毒20
• 1.2 主要实验仪器20-21
• 1.3 主要试剂和药品21
• 2 方法21-29
• 2.1 溶液配制22
• 2.2 灭活仙台病毒的制备22-23
• 2.2.1 仙台病毒的繁殖22
• 2.2.2 仙台病毒的浓缩22-23
• 2.2.3 仙台病毒效价的测定23
• 2.2.4 仙台病毒的灭活及感染力的验证23
• 2.3 PC3细胞的培养23-24
• 2.4 观察细胞形态24
• 2.5 CCK-8法测定细胞的生长抑制效果24
• 2.6 FACS(Annexin V/PI双染法)检测细胞凋亡24-25
• 2.7 FACS(探针DCFH-DA)检测细胞活性氧25
• 2.8 Western blot检测细胞凋亡蛋白的表达25-28
• 2.8.1 蛋白样品制备25
• 2.8.2 测蛋白浓度25-26
• 2.8.3 蛋白样品变性26
• 2.8.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳26-27
• 2.8.5 转膜27
• 2.8.6 免疫反应27-28
• 2.8.7 化学发光、曝光28
• 2.9 检测Caspase信号通路相关蛋白28
• 2.10 检测Z-VAD-FMK预处理后细胞的凋亡和Caspase-3蛋白28
• 2.11 检测MAPK信号通路相关蛋白28
• 2.12 检测MAPK通路各个抑制剂预处理后细胞凋亡和凋亡相关蛋白28-29
• 2.13 检测NAC预处理后细胞的凋亡率和凋亡相关蛋白29
• 3. 结果29-35
• 3.1 HVJ-E对PC3细胞增殖活性的影响29-30
• 3.2 HVJ-E对PC3细胞凋亡的影响30-31
• 3.3 Caspase信号通路在HVJ-E致PC3细胞凋亡中发挥作用31-32
• 3.4 MAPK信号通路在HVJ-E致PC3细胞凋亡中发挥作用32-33
• 3.5 测定了PC3细胞的凋亡率和凋亡相关蛋白的表达33-35
• 4. 讨论35-37
• 第二部分 自噬在HVJ-E致PC3凋亡中的作用37-42
• 1. 材料37-38
• 1.1 细胞株、病毒37
• 1.2 主要实验仪器37-38
• 1.3 主要试剂和药品38
• 2. 方法38-39
• 2.1 溶液配制38
• 2.2 细胞免疫荧光观察自噬小体38
• 2.3 Western blot检测自噬相关蛋白38-39
• 2.4 检测caspase-3、PARP、LC3的表达39
• 2.5 检测细胞凋亡率39
• 3. 结果39-41
• 3.1 HVJ-E可诱导PC3细胞发生自噬39-40
• 3.2 诱导自噬可促进HVJ-E致PC3细胞凋亡的效应40-41
• 4. 讨论41-42
• 全文结论42-43
• 参考文献43-52
• 致谢52-53

【参考文献】

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本文编号：526148