Rap2对微丝细胞骨架结构的调控及机制

发布时间：2017-07-18 19:04

  本文关键词：Rap2对微丝细胞骨架结构的调控及机制

  更多相关文章： Rap2 微丝细胞骨架 Rho家族蛋白 黏着斑蛋白

【摘要】：Rap2属于Ras家族中的Rap亚族,Rap亚族包括Rap1和Rap2,大量文献显示Ras、Rap1具有调控细胞骨架,细胞粘附等功能,而Rap2与Rap1在氨基酸序列上有60%同源性,与Ras有46%同源性,且Rap2特异效应分子MAP4K4、MINK、TINK、PARG均提示Rap2与微丝细胞骨架可能存在联系,本文主要阐明Rap2与微丝细胞骨架关系及其调控机制,为深入研究Rap2信号通路及其生物学功能奠定基础。本文首先利用免疫荧光方法静态比较在稳定表达和瞬时表达Rap2的微丝细胞骨架的形态改变情况,发现在Rap2过表达的NC65,CRL1932,CCF-RC-2细胞中,有60%以上细胞明显变圆,应力纤维排布明显紊乱,细胞失去原有铺展状态,且肌动蛋白与Rap2有共定位的趋势,其次利用活细胞工作站的方法动态观察Rap2对微丝细胞骨架动态变化,Rap2过表达的细胞中,细胞极性消失,微丝骨架紊乱,Rap2干扰后细胞运动能力减慢,应力纤维减弱,并提前进入凋亡状态。对于机制的探索,利用GST-Pull Down实验发现在Rap2过表达的细胞中,Rap2显著下调Rho A蛋白活性,增高Rac活性,降低Cdc42活性;免疫荧光方法在CRL1932、CRL1933瞬时表达Rap2后分别FAKY397、Paxillin,Vinculin染色,发现在Rap2过表达后,约60%细胞极性丧失或者伪足呈均一化分布,且Rap2抑制FAKY397磷酸化水平。综上所述,Rap2对微丝细胞骨架改变明显,通过下调Rho蛋白活性,增高Rac活性,降低Cdc42活性和改变黏着斑分布极性等使细胞变小变圆,应力纤维减弱,应力纤维排布紊乱,微丝骨架紊乱。
【关键词】：Rap2 微丝细胞骨架 Rho家族蛋白 黏着斑蛋白
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q343;R737.11
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 第1章 绪论8-23
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义8-9
• 1.2 Rap2 简介9-12
• 1.2.1 Rap2 的基本结构特征9-10
• 1.2.2 Rap2 活性调节10
• 1.2.3 Rap2 的下游效应分子10-11
• 1.2.4 Rap2 的生物学功能11-12
• 1.3 微丝细胞骨架研究现状12-15
• 1.3.1 微丝的组成及其动态组装12-13
• 1.3.2 Rho家族蛋白对微丝细胞骨架的影响13-14
• 1.3.3 Rap家族与骨架蛋白联系14-15
• 1.4 粘着斑复合体研究现状15-21
• 1.4.1 粘着斑蛋白FAK、Paxillin、Vinculin简介15-17
• 1.4.2 FAK信号通路17-18
• 1.4.3 FAK与Ras家族关系18-19
• 1.4.4 FAK与癌症的关系19-21
• 1.5 本文主要研究内容21-22
• 1.6 技术路线22-23
• 第2章 实验材料与方法23-32
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 细胞系23
• 2.1.2 质粒23
• 2.1.3 主要试剂材料及试剂配方23-25
• 2.1.4 主要仪器25
• 2.1.5 主要分析软件25
• 2.2 实验方法25-32
• 2.2.1 细胞培养、转染及收集25-27
• 2.2.2 免疫荧光27-28
• 2.2.3.稳转细胞系的筛选28
• 2.2.4.活细胞工作站28-29
• 2.2.5 GST融合蛋白的诱导表达29
• 2.2.6 GST-Pull Down29-30
• 2.2.7 Western Blotting30-32
• 第3章 Rap2 对微丝细胞骨架表型的影响32-42
• 3.1 Rap2 对微丝细胞骨架的静态变化32-37
• 3.2 Rap2 对微丝细胞骨架的动态变化37-40
• 3.3 讨论40
• 3.4 本章小结40-42
• 第4章 Rap2 诱导微丝细胞骨架表型的机制42-55
• 4.1 Rap2 对Rho家族蛋白活性的影响42-43
• 4.2 Rap2 对粘着斑复合体分布的影响43-51
• 4.3 Rap2 对FAKY397磷酸化水平影响51-52
• 4.4 讨论52-53
• 4.5 本章小结53-55
• 结论55
• 展望55-56
• 参考文献56-65
• 致谢65

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本文编号：559270