miR-200a调控β-catenin在肾小管上皮细胞转分化中的作用

发布时间：2017-07-19 17:37

  本文关键词：miR-200a调控β-catenin在肾小管上皮细胞转分化中的作用

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【摘要】：背景和目的:肾间质纤维化(renal interstital fibrosis,RIF)是各种不同类型的慢性肾脏病进行性发展的最终结局。肾小管上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT)是RIF的重要发病机制。Wnt/β-catenin信号通路是一个复杂、保守的细胞间生物通路,在生物发育和疾病中调控着细胞功能、表型等。β-catenin是Wnt/β-catenin信号转导通路的关键分子,在不同类型的纤维化疾病中起着重要作用。MicroRNAs(miRNAs)是生物体内一类非编码小RNA,参与调节细胞的增殖、分化与凋亡。近年来随着miR-200a在肿瘤方面研究的深入,其在纤维化疾病的作用日益受到重视。有研究报道miR-200a在肝、肺纤维化中起着重要作用,但miR-200a在肾间质纤维化中的作用机制仍不清楚。本课题用TGF-β1诱导HK-2细胞上皮间质转分化,观察miR-200a和β-catenin的表达变化;用双荧光素酶报告系统证实miR-200a以β-catenin的基因CTNNB1为靶标;以外源性干预miR-200a的表达,观察其对β-catenin和上皮细胞间质转分化的影响;用干扰RNA阻断β-catenin表达,反证β-catenin在miR-200a调控小管上皮间质转分化中的重要作用。确立miR-200a直接以β-catenin为靶点调控小管上皮间质转分化。这为干预肾间质纤维化的发生提供了新的实验依据,为肾间质纤维化的治疗提供新靶点。方法:1.TGF-β1诱导对体外培养HK-2细胞miR-200a和β-catenin的影响,将HK-2细胞,分为0h组、12h组、24h组、48h组,用终浓度为10ng/ml的TGF-β1分别作用12h、24h、48h;q PCR检测各组miR-200a的表达,q PCR和Western Blot检测各组HK-2细胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达情况。2.agomir(miR-200a激动剂)和antagomir(miR-200a抑制剂)对HK-2细胞miR-200a表达的影响,HK-2细胞分为4组:(1)control组:用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养细胞;(2)NC-miRNA组:向细胞转染NC-miRNA(阴性对照miRNA);(3)agomir组:向细胞转染agomir(50n M);(4)antagomir组:向细胞转染antagomir(100n M)。48h后q PCR检测miR-200a的表达情况。3.运用双荧光素酶报告质粒(β-catenin基因野生型/突变型,CTNNB1 UTR WT/MT)验证miR-200a与β-catenin的作用靶点关系,HK-2细胞分为4组:(1)control组:向细胞转染CTNNB1 UTR WT/MT质粒;(2)NC-miRNA组:向细胞转染CTNNB1 UTR WT/MT质粒和NC-miRNA;(3)antagomir组:向细胞转染CTNNB1 UTR WT/MT质粒和antagomir;(4)agomir组:向细胞转染CTNNB1 UTR WT/MT质粒和agomir。48h后双荧光素酶检测试剂盒检测荧光活性。4.上调miR-200a(agomir)对TGF-β1诱导的β-catenin及小管EMT的影响,HK-2细胞分为4组:(1)control组:用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养HK-2细胞;(2)TGF-β1组:用10ng/ml TGF-β1诱导HK-2细胞;(3)NC-miRNA+TGF-β1组:向细胞转染NC-miRNA并用10ng/ml TGF-β1诱导细胞;(4)agomir+TGF-β1组:向细胞转染agomir并用10ng/ml TGF-β1诱导细胞。48h后q PCR和Western Blot检测细胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测E-cadherin和α-SMA的表达情况。5.下调miR-200a(antagomir)对β-catenin及小管EMT的影响,HK-2细胞分为3组:(1)control组:用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养细胞;(2)NC-miRNA组:向细胞转染NC-miRNA;(3)antagomir组:向细胞转染antagomir。48h后q PCR和Western Blot检测细胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测E-cadherin和α-SMA的表达情况。6.β-catenin siRNA转染对细胞β-catenin的影响,HK-2细胞分为3组:(1)control组:用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养细胞;(2)NC-siRNA(干扰RNA的阴性对照)组:向细胞转染NC-siRNA;(3)si R-β-catenin组:向细胞转染β-catenin siRNA。各组细胞培养至48h进行q PCR和Western Blot检测β-catenin表达。7.干扰β-catenin对antagomir诱导的EMT的影响,HK-2细胞分为4组:(1)control组:用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养细胞;(2)antagomir组:向细胞转染antagomir;(3)antagomir+NC-siRNA组:向细胞转染antagomir和NC-siRNA;(4)antagomir+si R-β-catenin组:向细胞转染antagomir和β-catenin siRNA。48h后q PCR和Western Blot检测细胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达情况。结果:1.TGF-β1诱导下细胞miR-200a、β-catenin及转分化指标的表达情况q PCR检测结果示miR-200a在0h组呈高表达,在TGF-β1作用12h时miR-200a表达出现明显下调(与0h组比,P0.05),48h时miR-200a表达最低(与0h组比,P0.05);β-catenin的mRNA和蛋白在0h组呈低表达,24h出现明显增多(与0h组比,P0.05),48h上升到最高(与0h组比,P0.05)。E-cadherin的mRNA和蛋白在0h组呈高表达,在24h出现明显降低(与0h组比,P0.05),48h降到最低(与0h组比,P0.05);α-SMA和FN的表达则与E-cadherin的表达相反,12h出现明显上调(与0h组比,P0.05),在48h表达最高(与0h组比,P0.05)。提示在TGF-β1诱导小管上皮间质转分化中miR-200a表达下调,而β-catenin表达上调。2.agomir(miR-200a激动剂)和antagomir(miR-200a抑制剂)对HK-2细胞miR-200a表达的影响q PCR检测结果示,miR-200a的表达在NC-miRNA组与control组无明显差别(P0.05);在agomir组miR-200a表达较NC-miRNA组明显增多(P0.05),在antagomir组其表达较NC-miRNA组明显减少(P0.05)。提示agomir上调miR-200a表达,antagomir下调miR-200a表达。3.双荧光素酶实验检测miR-200a与β-catenin的作用靶点双荧光素酶检测结果显示,转染CTNNB1 UTR MT质粒的各组间相对荧光活性比值无明显差异(P0.05);转染CTNNB1 UTR WT质粒的各组,control组和NC-miRNA组无明显差异,但在antagomir组荧光活性比值较NC-miRNA组明显升高(P0.05),在agomir组荧光活性比值较NC-miRNA组明显降低(P0.05)。提示miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1为靶标。4.上调miR-200a(agomir)对TGF-β1诱导的β-catenin及小管EMT的影响细胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达在TGF-β1组和NC-miRNA+TGF-β1组之间无明显差异(P0.05);在TGF-β1组,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达较control组明显增多(P0.05),E-cadherin的mRNA和蛋白表达较control组明显减少(P0.05);在agomir+TGF-β1组,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达较NC-miRNA+TGF-β1组明显下调(P0.05),同时较TGF-β1组明显下调(P0.05),E-cadherin的mRNA和蛋白表达则较NC-miRNA+TGF-β1组明显上调(P0.05),同时较TGF-β1组明显上调(P0.05)。细胞免疫荧光结果与蛋白结果一致,即E-cadherin荧光在TGF-β1组较control组显著减弱,在agomir+TGF-β1组则较NC-miRNA+TGF-β1组明显增强;α-SMA荧光在TGF-β1组较control组明显增强,在agomir+TGF-β1组则较NC-miRNA+TGF-β1组显著减弱。提示上调miR-200a减弱TGF-β1诱导的β-catenin表达,抑制小管上皮间质转分化5.下调miR-200a(antagomir)对β-catenin及小管EMT的影响细胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达在control组与在NC-miRNA组无明显差别(P0.05);在antagomir组,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达较NC-miRNA组明显升高(P0.05);E-cadherin的mRNA和蛋白表达则较NC-miRNA组明显降低(P0.05)。细胞免疫荧光显示,在control组和NC-miRNA组,E-cadherin出现明显红色荧光,α-SMA则有少许微弱的荧光;在antagomir组E-cadherin荧光明显减弱,α-SMA荧光显著增强。提示下调miR-200a可增加β-catenin表达,促进小管上皮间质转分化。6.β-catenin siRNA对细胞β-catenin表达的影响在control组和NC-siRNA组β-catenin的mRNA表达无明显差别(P0.05),但在si R-β-catenin组,β-catenin表达较NC-siRNA组明显下调(P0.05);Western Blot结果与q PCR结果相符,即β-catenin表达在control组和NC-siRNA组正常表达,但在si R-β-catenin组较NC-siRNA组表达显著减少(P0.05)。提示β-catenin siRNA抑制β-catenin表达。7.干扰β-catenin对antagomir诱导的小管上皮间质转分化的影响细胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达在antagomir组与antagomir+NC-siRNA组无明显差异(P0.05);在antagomir组,E-cadherin的mRNA和蛋白表达较control组显著减少(P0.05),α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达则较control组显著增加;在antagomir+si R-β-catenin组,E-cadherin的mRNA和蛋白表达较antagomir+NC-siRNA组表达上调(P0.05);α-SMA和FN的mRNA和蛋白表达则较antagomir+NC-siRNA组表达下调(P0.05)。提示β-catenin siRNA抑制antagomir诱导的小管上皮间质转分化,反证了miR-200a直接调控β-catenin影响肾小管上皮间质转分化结论:1.在TGF-β1诱导小管上皮间质转分化中miR-200a表达下调,而β-catenin表达上调;2.miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1为靶标;3.上调miR-200a减弱TGF-β1诱导的β-catenin表达,抑制小管上皮间质转分化;下调miR-200a可增加β-catenin表达,促进小管上皮间质转分化;4.β-catenin siRNA抑制antagomir诱导的小管上皮间质转分化,反证了miR-200a直接调控β-catenin影响肾小管上皮间质转分化;由此得出,miR-200a通过直接以β-catenin为靶标抑制TGF-β1诱导的小管上皮间质转分化。
【关键词】：miR-200a β-catenin 上皮间质转分化 肾间质纤维化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 前言15-17
• 材料与方法17-32
• 结果32-46
• 讨论46-52
• 全文结论52-53
• 参考文献53-57
• 文献综述 miRNA-200 家族与肾间质纤维化57-63
• 参考文献60-63
• 攻读学位期间发表的论文63-64
• 致谢64

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本文编号：564097