氯胺酮及衍生物Methoxetamine引起膀胱功能障碍的机制研究

发布时间：2017-07-19 23:20

  本文关键词：氯胺酮及衍生物Methoxetamine引起膀胱功能障碍的机制研究

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【摘要】：背景氯胺酮(Ketamine, KET)作为一种N-甲基-D天门冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid, NDMA)受体拮抗剂,活跃在临床麻醉和镇痛领域已有半个世纪,但由于能引起强烈的欣快感、幻觉、濒死感,使其很快成为娱乐场所流行的滥用药物”K粉”。早期对氯胺酮滥用的研究像其他毒品一样主要集中在精神、神经系统改变。自Shahani在2007年发现9名滥用氯胺酮而引起严重的下尿路症状(lower urinary tract symptoms, LUTS)的青年,在欧洲、亚洲陆续报道了大量病例,氯胺酮相关性泌尿系统损害(Ketamine Associated Urinary Dysfunction, KAUD)逐渐引起人们的重视。患者主要以下尿路症状为主,逐渐进展可导致膀胱挛缩和上尿路损害,严重影响生活质量。但由于其临床特点、发病机制尚不明确,尚无统一规范的治疗指导。距离该病被广泛发现已有8年时间,病情不断进展的患者逐渐增多,保守治疗针对此类难治性的患者效果不佳。临床分期可以从一定程度上判断疾病的进展,同时也是为疾病的评估和治疗方案的选择提供指导,对避免延误和过度医疗有很重要的作用。KAUD有其特殊的复杂性,除了膀胱的受累之外,上尿路也会随病程进展发生不同程度的病变。现有的报道中各种治疗的效果不一,疾病的进展很可能是影响因素之一,仅根据经验判断治疗的策略和时机并不绝对可靠,尤其关于外科手术干预时机引起了专家们的思考。目前,尚未有研究尝试对氯胺酮相关性泌尿系统损害的疾病进展进行分期评估,因此本研究第二部分通过回顾氯胺酮相关性泌尿系统损害患者的病史、实验室和影像学资料,提出相应的评分分期系统,是首次根据疾病的进展进行临床分期,并为阶梯式治疗策略提供依据。Methoxetamine (MXE)是氯胺酮的结构衍生物,同样是NDMA受体拮抗剂。另外,MXE可以结合血清素转运体(serotonin transporter, SERT),降低5羟色胺的再摄取,从而引起脑中5羟色胺水平增高,且证实可增加多巴胺释放和阻止多巴胺的再摄取。MXE最初是为了减少KET的泌尿系统毒性和其抗抑郁作用而合成的。作为新型合成的精神类药品,MXE的研究历史并不长。它的作用在2010年时首次被报道,同氯胺酮类似,包括欣快、冷静、幻觉、感官加强、躯体分离、濒死感等。现今MXE的潜在危害作用还没有被广泛认识,只有9个国家明令禁止使用MXE,除欧洲和美洲国家8个国家外,亚洲地区只有日本对MXE颁布了禁令。因此,在大部分国家购买MXE不需要任何凭证和授权,加上互联网的作用,获取MXE甚至比KET更为容易。MXE最初是为了减少KET的泌尿系统毒性和其抗抑郁作用而合成的,但是,有学者2014年采用小鼠暴露于MXE,发现MXE对于膀胱和肾脏均有一定毒性作用。现阶段,关于MXE的化学、药理学和毒理学研究有很大空白,那么MXE对于泌尿系统是否真的具有损害作用,迫切需要研究数据进一步说证实。为此,在本研究第二部分中,我们借鉴较为成熟的氯胺酮相关性膀胱炎动物模型,分别给予SD大鼠MXE和KET腹腔注射,研究MXE对泌尿系统的损害作用,并与KET引起的KC进行比较,探讨二者对于泌尿系统相似的作用模式。在研究的第三部分,我们采用人膀胱上皮细胞,研究MXE和KET对于刺激细胞产生促炎性细胞因子和趋化因子的作用。方法1.氯胺酮相关性泌尿系统损害的评分分期评估及临床价值回顾性分析2009年9月至2015年9月我院收治的氯胺酮相关性泌尿系统损害患者的病史、实验室和影像学资料。满足资料齐全且符合纳入排除标准的患者,资料纳入下一步分析,具体为：入院时均进行病史采集、记录膀胱日记、进行PUF评分(Pelvic Pain and Urgency/Frequency questionnaire), ICPI (interstitial cystitis problem index)和ICSI (interstitial cystitis symptom index)评分。完善肝肾功能、B超、CT及放射性核素肾图(Single-Photon Emission Computed Tomography, SPECT)检查。共纳入135例KAUD患者,所有患者根据膀胱和上尿路受累情况分为3期,采用阶梯化的治疗策略。泌尿系统影像学无明显异常的患者为I期,采用行为(戒断氯胺酮等)和药物综合治疗(抗炎、抗组胺药物、皮质激素、胆碱能受体阻滞剂、肾上腺能受体阻滞剂、改善微循环药物、对症止痛药物等)。影像学或尿动力提示膀胱病变,而上尿路无形态学和功能学异常为II期,在保守治疗基础上行膀胱水扩张术及定期碱化肝素利多卡因膀胱灌注。经上述干预后,上尿路影像学及肾功异常持续进展的患者为III期,在上述治疗效果欠佳时考虑行肠膀胱扩大术或膀胱全切原位新膀胱术。对患者一般资料、氯胺酮滥用史、肾功能、肝功能、影像学和尿动力学检查结果与临床分期的关系进行相关分析。评价治疗前和治疗后1个月由患者3日膀胱日记反映的平均排尿量、排尿间隔时间、夜尿次数、PUF评分、ICPI和ICSI评分。将患者氯胺酮滥用史、肾功能、肝功能、影像学提示的膀胱及上尿路病变,尿动力学检查和肾动态显像这7项指标进行分类资料转换并建立评分系统,分别设置评分。所有患者根据规则进行评分,比较该评分分期与临床分期是否相一致。绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC),检测评分系统预测分期的敏感性和特异性。计算评分曲线下面积(area under roc curve, AUC)和95%CI。2.氯胺酮类似物methoxetamine引起大鼠膀胱组织炎症和功能障碍雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠36只,体重180-220g。将36只大鼠随机分为6组,每组6只,分别为对照1月组,对照3月组,MXE 1月组,KET 1月组,MXE 3月组和KET 3月组。每只大鼠每日腹腔注射氯胺酮溶液,注射剂量为30mg/kg,注射量根据每周大鼠体重变化进行计算。每周采用称重仪对所有大鼠进行称量,监测体重变化。分别在1月和3月建模结束前采用代谢笼饲养大鼠24小时,记录其24小时摄水量,收集大鼠24小时排出的尿液。采用代谢笼饲养大鼠,自由摄水取食,采用尿液显色试纸,置于代谢笼下,观察大鼠排尿2小时,根据试纸排尿印记观察大鼠排尿次数和行为变化。大鼠麻醉后,硬膜外导管经尿道插入膀胱,排空膀胱内尿液。用三通连接微量输液泵、尿动力仪膀胱压力传感器和硬膜外导管。微量泵以0.2ml/min,向膀胱内灌注生理盐水,在灌注过程中观察是否出现尿液溢出。当膀胱压力升高且有尿液排出时,此时的膀胱收缩为正常收缩,膀胱压力为排尿时膀胱最大压力(Maximum pressure,MP),膀胱最大容量(Maximum cystometric capacity, MCC)为灌注时间乘以灌注速度。当膀胱压力升高而没有排尿行为时,此时的膀胱收缩为逼尿肌不稳定收缩(Non-voiding Contraction)。每只老鼠至少连续测定5个排尿周期以上。在最后一次排尿后,通过注射器连接导管抽出膀胱残余尿,即为残余尿量(Post Void Residual, PVR)。处死大鼠后取膀胱,组织放入液氮中保存。制作石蜡切片,进行HE染色、阿利新蓝染色、甲苯胺蓝染色和masson染色。Western Blot法验证膀胱组织a-SMA, Collagen I, Fibronectin表达丰度。荧光定量PCR检测细胞因子、趋化因子和纤维化相关产物(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF, TGF-β,a-SMA, Collagen I, Collagen III和Fibronectin)。3.氯胺酮类似物Methoxetamine对人膀胱上皮细胞的作用培养SV-HUC-1细胞,采用Cell Counting Kit-8试剂盒,细胞铺板后加入含有0、0.125mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM、2mM、4mM和8mM浓度梯度的MXE/KET溶液,孵育24小时和48小时后加入CCK-8溶液,培养箱内孵育2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度,计算各孔细胞活力。荧光定量PCR检测Methoxetamine和Ketamine刺激细胞后产生细胞因子和趋化因子(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF和TGF-p)。结果1.双变量相关分析显示,患者年龄、氯胺酮滥用时长、排尿间隔时间、夜尿次数、PUF评分、ICPI评分、ICSI评分同患者的临床分期相关。在辅助检查中,eGFR (r=-0.274, P=0.001)、ALT (r=0.18, P=0.037)、γ-GT (r=0.456, P0.001)、膀胱壁增厚(r=0.238,P=0.013)、输尿管病变(r=0.509,P0.001)、肾积水(r=0.522,P0.001)和核素肾图的异常比例(r=0.287,P=0.01)与临床分期呈不同程度的相关关系,而尿动力检查的结果提示临床分期与膀胱感觉敏感(r=0.419,P0.001)和逼尿肌改变(过度活动或活动低下,r=0.704,P0.001)的比例呈正相关。在经过方法所述的方案治疗后,3期患者的排尿间隔时间有所延长,平均排尿量明显增加,夜尿次数减少,PUF评分、ICPI和ICSI评分较治疗前明显下降(P0.05)。39例临床I期患者得分为(4.92±1.94)分,其中30例(76.9%)仍被诊断为I期,而9例(22.1%)判为Ⅱ期。临床Ⅱ期患者得分为(8.79±2.16)分,其中65例(81.2%)仍被诊断为Ⅱ期,12例(15.0%)被错判为Ⅰ期,3例(3.75%)被错判为Ⅲ期。临床Ⅲ期患者得分为(14.6±2.25)分,12例(75.0%)被正确诊断为Ⅲ期,4例(25.0%)被归为Ⅱ期。135例中共有107例(79.2%)由评分得出的分期与临床分期相同,而28例(20.7%)评分分期与临床分期不符合。该评分系统在判断Ⅰ期和Ⅱ期临界值(即评分6分为临界值)时,评分ROC的AUC为0.922,95%CI为0.879～0.965(图1A),而当判断Ⅱ期和Ⅲ期临界值(即评分12分为临界值)时,评分ROC的AUC为0.978,95%CI为0.952-1.000(图1B)。2.大鼠经过1个月和3个月的MXE和KET腹腔注射后,体重增加明显少于对照组,而MXE更加明显。24H的饮水量和尿量,对照组、MXE和KET组在1月和3月时均没有明显差异。1月时,MXE和KET组大鼠排尿次数较对照组明显增多。而3月时,MXE和KET组大鼠排尿次数明显多于对照组,而KET组尿频程度较MXE组更为严重。大鼠的尿动力学显示,长期使用MXE和KET后,大鼠的排尿次数、逼尿肌不稳定收缩、膀胱最大压力明显增高,而膀胱最大容量、膀胱顺应性、排尿量和排尿效率明显降低,且随接触药物时间延长而更加严重。大鼠膀胱组织的HE染色提示,MXE和KET组出现了上皮层变薄甚至缺失,固有层和黏膜下层炎性细胞浸润,存在不同程度的血管扩张,而对照组未发现类似的变化。阿里新蓝染色反映了MXE和KET组上皮层的糖蛋白含量明显低于对照组,而MXE和KET组之间明显明显差异。甲苯胺蓝染色实验显示MXE和KET组巨噬细胞浸润比例增高。马松染色发现了同对照组相比,MXE和KET组大鼠膀胱肌层中胶原表达明显增高,而二者之间没有明显差异。Western Blot显示MXE和KET组大鼠膀胱组织a-SMA, Collagen I, Fibronectin表达丰度较对照组明显增强。荧光定量PCR证实促炎性因子、趋化因子和纤维化相关产物(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF, TGF-β,a-SMA, Collagen I, Collagen III和Fibronectin)均有不同程度的升高,且MXE 3月和KET 3月组较1月组升高更为明显。3. SV-HUC-1细胞在使用MXE和KET刺激24小时和48小时后,细胞活性逐渐随MXE和KET的浓度升高而降低。在MET和KET分别为0.25和0.5mM时,SV-HUC-1细胞活性同PBS对照组相比,活性约为80%。因此认为此浓度对细胞活性无明显致死影响,可用于下一步实验。SV-HUC-1细胞在0.25和0.5mM的MXE和KET刺激24和48小时后,qPCR显示细胞因子IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF,TGF-p表达水平明显升高,氧化应激标记物COX-2也出现了表达上升。结论1.通过氯胺酮滥用史、实验室检验及影像学检查对氯胺酮相关性泌尿系统损害的评分分期系统,可能有助于评估膀胱及上尿路病情发展阶段,对治疗方式的选择有一定的指导作用。该评分系统仍有待于进一步验证和完善。2.氯胺酮类似物methoxetamine能够引起大鼠尿频、膀胱容量减少、顺应性降低和逼尿肌不稳定收缩等膀胱功能障碍。3.大鼠膀胱组织病理证实methoxetamine导致膀胱部分上皮缺失、上皮表面糖蛋白减少、黏膜下炎性细胞浸润和血管增生扩张,肌层出现胶原沉积,并伴随纤维化相关产物上调,与氯胺酮对膀胱损害的病理特点相似。4.长期接触Methoxetamine的大鼠出现膀胱组织炎症,组织中多种促炎性因子和趋化因子(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF, TGF-β)表达水平增高。5. Methoxetamine刺激人膀胱上皮细胞后,也会直接刺激细胞引起上述细胞因子和趋化因子的产生明显增多。
【关键词】：氯胺酮 临床分期 评分系统 Methoxetamine 膀胱炎 细胞因子
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R694.5
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第一部分 前言22-24
• 第二部分 氯胺酮相关性泌尿系统损害的评分分期评估及临床价值24-35
• 第一节 对象与方法24-27
• 1.1 入组条件24
• 1.2 纳入和排除标准24
• 1.3 患者一般资料24
• 1.4 临床分期和干预24-25
• 1.5 评价指标25
• 1.6 分期系统建立25-26
• 1.7 统计学方法26-27
• 第二节 结果27-32
• 第三节 讨论32-35
• 第三部分 氯胺酮类似物methoxetamine引起大鼠膀胱组织炎症和功能障碍35-61
• 第一节 主要仪器设备和试剂35-36
• 1.1 主要仪器35
• 1.2 主要试剂35-36
• 第二节 实验方法36-43
• 2.1 实验动物及分组36
• 2.2 模型建立36
• 2.3 行为学观察36
• 2.4 大鼠膀胱测压36-37
• 2.5 取材与切片制作37-38
• 2.6 组织切片染色38-39
• 2.7 免疫组化实验检测α-SMA,Collagen Ⅰ,Fibronectin在膀胱组织中的表达39-40
• 2.8 荧光定量PCR检测细胞因子、趋化因子和纤维化相关产物40-43
• 2.9 统计方法43
• 第三节 实验结果43-57
• 3.1 行为学改变43-45
• 3.2 大鼠膀胱测压结果45-51
• 3.3 组织切片染色改变51
• 3.4 免疫组化实验证实膀胱组织上调α-SMA,Collagen Ⅰ,Fibronectin51-52
• 3.5 荧光定量PCR证实细胞因子、趋化因子和纤维化相关产物表达升高52-57
• 第四节 讨论57-61
• 第四部分 氯胺酮类似物Methoxetamine对人膀胱上皮细胞的作用61-73
• 第一节 主要仪器设备和试剂61-62
• 1.1 细胞系61
• 1.2 主要仪器61
• 1.3 主要试剂61-62
• 1.4 其他试剂配制62
• 第二节 Methoxetamine和Ketamine对于膀胱上皮细胞的毒性作用62-65
• 2.1 细胞培养62-63
• 2.2 CCK-8实验原理63
• 2.3 实验步骤63-64
• 2.4 数据统计64
• 2.5 实验结果64-65
• 第三节 荧光定量PCR检测Methoxetamine和Ketamine刺激细胞后产生促炎性因子和趋化因子65-68
• 3.1 所用引物65-66
• 3.2 实验步骤66-67
• 3.3 数据统计67
• 3.4 实验结果67-68
• 第四节 讨论68-73
• 全文总结73-74
• 参考文献74-80
• 硕士研究生期间参与发表论文情况80-81
• 致谢81-83

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1 王强;氯胺酮及衍生物Methoxetamine引起膀胱功能障碍的机制研究[D];南方医科大学;2016年

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本文编号：565317