氧化苦参碱对肾缺血再灌注损伤的保护性作用的研究

发布时间：2017-07-25 16:27

  本文关键词：氧化苦参碱对肾缺血再灌注损伤的保护性作用的研究

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【摘要】：目的：探讨氧化苦参碱(OMT)在肾缺血再灌注损伤(RIRI)中的保护性作用。方法：第一部分：首先进行OMT细胞毒性实验,以0.1 mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、 2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml6个浓度梯度处理人肾小管上皮细胞HK-2细胞,于24h及48h朋CCK-8法检测细胞活力。建立RIRI细胞模型：乏氧盒中无糖无血清培养2h模拟缺血状态,放回正常培养箱培养3h模拟再灌注状态。参考毒性试验结果,选用高、低两种浓度OMT预处理HK-2细胞,与正常细胞同时造模,观察细胞形态差异并检测细胞活力,评估疗效以确定后续实验药物浓度。使用最佳实验浓度的OMT预处理HK-2细胞24h后进行造模(OMT+IR组),设置对照组：control组(正常培养),OMT组(OMT预处理24h后正常培养),IR组(与OMT+IR组同时铺板造模,不加药)。显微镜下观察各组细胞形态学改变,并采用CCK-8法测细胞活力、流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法定量检测HK-2细胞凋亡情况,分析比较各组间数据,评估OMT对于RIRI细胞模型的作用。qPCR法检测各组细胞中PERK/ATF4/CHOP通路相关mRNA的表达,探索OMT保护性作用的可能机制。第二部分：将32只健康雄性ICR小鼠随机分为sham组、OMT组、IR组及OMT+IR组,每组8只小鼠。OMT组及OMT+IR组术前连续4天及术后即刻腹腔注射给药OMT 120mg/kg; sham组和IR组注射生理盐水0.1ml。建立RIRI动物模型：手术切除右肾,游离左肾血管并以血管夹夹闭50min,肾脏颜色由红变黑提示阻断成功,松开阻断后肾脏颜色由黑变红提示再灌注成功。IR及OMT+IR组根据上述方法建模；sham和OMT组仅切除右肾、游离左肾血管,不阻断血供。再灌注24h后收集血清标本及肾脏组织标本。检测血清中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平,评估肾脏功能；检测组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,评估氧化应激水平；肾脏组织切片HE染色观察组织形态学的改变,并进行组织病理学评分；Tunel法检测肾脏组织细胞凋亡情况。分析比较各组间数据,评估OMT对RIRI动物模型的作用。通过qPCR的方法检测各组小鼠肾脏组织中PERK/ATF4/CHOP相关mRNA的表达,验证体外实验结果。结果：第一部分：细胞毒性试验显示：1mg/ml及更低浓度的OMT处理细胞48h,细胞活力较control组无明显差异(P0.05)。药物疗效实验显示：模型组(包括IR组、OMT+IR组)细胞活力显著低于control组(P0.01),OMT+IR组细胞活力高于瓜组(P0.05)。模型组显微镜下观察可见明显细胞凋亡坏死表现,流式细胞仪分析发现模型组凋亡细胞明显增多,相较对照组具有显著统计学差异(P0.001),OMT+IR组细胞凋亡比例较IR组有所下降(P0.05)。模型组细胞中相关mRNA表达均显著上升(P0.01)。OMT+IR组相关mRNA表达上升幅度低于IR组(P0.05)。第二部分：OMT+IR组小鼠血清Cr、BUN水平均明显低于R组(85.74± 5.976 vs 127.6±13.210,P0.05；28.60±2.805 vs 41.46±3.966,P0.05);OMT+IR组小鼠肾脏组织中SOD活性较IR组有所升高(109.90±4.498 vs 85.50±4.114, P0.05),MDA含量低于IR组(6.033±0.2705 vs 7.136±0.4254,P0.05);OMT+IR组小鼠肾脏组织病理学评分明显低于IR组(P0.05);OMT+R组小鼠肾脏组织凋亡细胞数较IR组明显减少(P0.01)。相较于假手术组,模型组小鼠肾脏组织中相关mRNA表达均有上升(P0.01)。OMT+IR组相关mRNA表达上升幅度低于IR组(P0.05)。结论：1.OMT可显著改善RIRI模型HK-2细胞的活力,减少细胞凋亡,即OMT对体外缺氧/复氧造成的HK-2细胞损伤有一定的保护性作用。2.OMT可显著改善RIRI模型小鼠的肾脏功能、减轻肾脏组织的病理性改变,并能起到抗氧化应激和抑制细胞凋亡的作用,即OMT对缺血再灌注造成的小鼠肾脏损伤有一定的保护性作用。3.体内体外实验均证实RIRI可使PERK/ATF4/CHOP信号通路关键mRNA表达上升；而OMT处理后相关mRNA表达下降,故推测阻碍PERK/ATF4/CHOP信号通路的激活,可能是OMT抑制细胞凋亡,减轻RIRI的关键机制之一。
【关键词】：肾缺血再灌注损伤 氧化苦参碱 氧化应激 细胞凋亡 内质网应激
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 缩略词表10-12
• 前言12-16
• 参考文献14-16
• 文献综述16-23
• 参考文献19-23
• 第一部分23-37
• 材料和方法23-31
• 实验结果31-34
• 讨论34-36
• 结论36-37
• 第二部分37-53
• 材料和方法37-45
• 实验结果45-49
• 讨论49-52
• 结论52-53
• 参考文献53-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

【参考文献】

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本文编号：572218