Beclin1进化保守区-SA融合蛋白偶联生物素-A10适配子制备PSMA靶向系统及其对前列腺癌细胞的抑制

发布时间：2017-07-30 01:21

  本文关键词：Beclin1进化保守区-SA融合蛋白偶联生物素-A10适配子制备PSMA靶向系统及其对前列腺癌细胞的抑制

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【摘要】：目的:构建链霉亲和素(streptavidin,SA)与Beclin1进化保守区(evolutionary conserved district,ECD)融合蛋白原核表达载体,将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统,鉴定其促进PSMA~+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能。方法:采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD,克隆至PUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体PET30a,IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blotting鉴定。按照生物素-A10∶SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统,凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证SA-ECD与生物素的结合,流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响。结果:双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功,IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化。EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10。靶向系统可促进PSMA~+前列腺癌细胞凋亡和自噬,同时抑制癌细胞活力。结论:成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD,构建的生物素-A10∶SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA~+前列腺癌细胞。
【作者单位】： 第四军医大学附属西京医院全军临床检验医学研究所;
【关键词】： 链霉亲和素 Beclin蛋白 进化保守区 融合蛋白 适配子A 前列腺癌 凋亡 自噬
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No.30973463)~~
【分类号】：R737.25
【正文快照】： 合蛋白( 含His标签) 进行纯化,收集的融合蛋白做SDS-PAGE、转膜,用封闭缓冲液室温封闭1 h、加入抗N端His抗体( 1∶ 2 500) 、加入二抗羊抗鼠Ig G( 1∶ 4 000) ,清洗后用Oddesy红外荧光扫描成像仪扫描成像。采用Bradford法测定融合蛋白的浓度。1. 4 PSMA靶向系统的构建 纯化的

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本文编号：591950