褪黑素缓解白消安造成的小鼠精原干细胞氧化应激和凋亡损伤机理的研究

发布时间：2017-08-13 21:56

  本文关键词：褪黑素缓解白消安造成的小鼠精原干细胞氧化应激和凋亡损伤机理的研究

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【摘要】：最新的统计学数据表明,中国每年新增的白血病患者,儿童已经占50%左右,这个比例正在逐年增加。在儿童恶性肿瘤中,白血病已经居于首位,且多发生于男性未成年的儿童。传统的化疗药物白消安已经广泛的应用于造血干细胞移植预处理,但是这种细胞周期非特异性的烷化剂会导致长期服用的男性出现不育的症状。随着治疗方法的改进,许多儿童和青少年白血病患者都可生存至成年并有生育要求。目前,对于不同剂量白消安导致睾丸生精障碍和白消安停药后恢复的中、长期研究资料匾乏。白消安在实验中被广泛的应用于制备精原干细胞移植受体。其利用白消安清除内源性的生精细胞,再移植外源性的精原干细胞到受体睾丸中,从而研究精子发生等一些列实验。不同物种使用白消安的剂量具有很大的差异:小鼠腹腔注射剂量约为20-40 mg/kg,大鼠腹腔注射剂量约为15 mg/kg,8-12 mg/kg剂量的白消安腹腔注射后很有可能使得猕猴生精功能不可恢复。腹腔注射白消安后,机体通过体液循环将其运送到睾丸组织,导致睾丸曲细精管中生殖细胞的发生过程受到损伤。如果未损伤精原干细胞,停止注射白消安后,经过8-10周,睾丸中精子的再生功能就可以重新启动,生殖细胞即可进行正常的减数分裂。因此,研究白消安对睾丸中生殖细胞损伤的机理以及减少其副作用是非常有必要的。本研究采用ICR小鼠作为研究对象,腹腔注射白消安,建立无精症小鼠模型,从而研究白消安的生殖毒理机制。首先,构建好模型后,通过形态学、组织学、免疫荧光染色、CCK-8细胞活力检测确认白消安首先影响睾丸中精原干细胞,其次为精母细胞,且这种影响呈现时间和剂量依赖性。进一步采用TUNEL染色、流式凋亡检测、流式细胞周期检测、WB、PCR等手段确定白消安激活细胞内p38信号通路,从而引起细胞凋亡。在机理研究上,我们用流式细胞术检测了细胞内ROS水平,发现白消安加入后,细胞内H2O2、O2-水平大幅度上升,且MnSOD、SIRT1等清除氧自由基的相关基因的表达明显受到抑制。通过检测GSH/GSSG的比率,白消安能够对GSH产生毁灭性的消耗,极大的破坏细胞内ROS平衡。JC-1染色发现,失衡的ROS会影响线粒体的膜电位,从而引发细胞凋亡。我们采用体内实验证实,褪黑素能够有效的缓解白消安所致的小鼠睾丸细胞损伤,但是具有时间依赖性,已经造成的损伤无法逆转;体外实验证实,褪黑素能够有效地缓解白消安导致的细胞内ROS失衡,从而减少细胞凋亡的比率。本实验初步证明了白消安导致小鼠无精症的机理,并且确定白消安会造成生殖细胞凋亡主要是通过破坏细胞内ROS平衡,激活p38信号通路,而不是p53信号通路。同时也发现了褪黑素能够有效地缓解白消安造成的细胞凋亡,挽救由于白消安所致的无精症。为临床上治疗白消安并发症提供了一定的指导意义。
【关键词】：白消安 精原干细胞 褪黑素 氧化应激(ROS) 凋亡
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7;R698
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文献综述13-20
• 第一章 白消安和褪黑素在精原干细胞损伤中的研究进展13-20
• 1.1 精原干细胞与精子发生13-14
• 1.2 白消安研究进展14-16
• 1.2.1 白消安简介14-15
• 1.2.2 白消安在临床中的应用15
• 1.2.3 白消安与精子发生15-16
• 1.2.4 白消安与氧化应激16
• 1.3 抗白消安损伤药物的研究进展16
• 1.4 褪黑素的研究进展16-20
• 1.4.1 褪黑素的抗氧化作用16-17
• 1.4.2 褪黑素受体及其信号通路17-19
• 1.4.3 褪黑素与雄性生殖19
• 1.4.4 褪黑素的应用19-20
• 试验研究20-59
• 第二章 白消安对小鼠睾丸细胞的影响20-36
• 2.1 材料和方法20-28
• 2.1.1 实验材料20
• 2.1.2 实验试剂20-21
• 2.1.3 实验仪器21
• 2.1.4 相关试剂配制方法21-23
• 2.1.5 白消安受体鼠的制备23
• 2.1.6 白消安处理后受体鼠睾丸形态学与睾体比的分析23
• 2.1.7 白消安处理后受体鼠睾丸组织学分析23-24
• 2.1.8 白消安处理后受体鼠睾丸组织特异性蛋白免疫荧光染色分析24
• 2.1.9 不同类型睾丸细胞经白消安处理后细胞活力分析24-25
• 2.1.10 白消安处理后受体鼠睾丸组织悬液制备25
• 2.1.11 受体鼠睾丸悬液流式细胞术细胞周期、凋亡检测分析25
• 2.1.12 受体鼠睾丸组织切片TUNEL凋亡检测分析25-26
• 2.1.13 受体鼠睾丸组织定量检测分析26-27
• 2.1.14 Western Blot检测白消安对于C18-4 的影响27-28
• 2.1.15 稳定性分析28
• 2.2 结果28-34
• 2.2.1 白消安会造成小鼠睾丸萎缩、睾体比下降28
• 2.2.2 白消安会造成小鼠精原细胞丢失28-29
• 2.2.3 白消安对小鼠睾丸细胞活力的影响具有时间、剂量依赖性29-30
• 2.2.4 白消安会造成小鼠睾丸细胞周期阻滞30-31
• 2.2.5 白消安会造成小鼠睾丸内精原细胞凋亡31-32
• 2.2.6 白消安会造成小鼠睾丸细胞应激水平增高32-33
• 2.2.7 白消安造成细胞凋亡是通过p38-ERK通路33-34
• 2.3 讨论34-35
• 2.4 小结35-36
• 第三章 褪黑素能够缓解白消安引起的小鼠睾丸细胞凋亡36-49
• 3.1 材料和方法36-40
• 3.1.1 实验材料36
• 3.1.2 实验试剂36
• 3.1.3 实验仪器36-37
• 3.1.4 实验主要试剂配制方法37-38
• 3.1.5 褪黑素挽救白消安损伤模型的建立38
• 3.1.6 睾丸中褪黑素受体检测38
• 3.1.7 褪黑素对于C18-4 细胞氧化应激相关基因的功能检测38-39
• 3.1.8 褪黑素挽救白消安损伤模型小鼠睾丸组织学检测39
• 3.1.9 褪黑素挽救白消安损伤模型小鼠睾丸中减数分裂检测39-40
• 3.1.10 褪黑素缓解白消安对于C18-4 细胞毒性检测40
• 3.1.11 数据及稳定性分析40
• 3.2 结果40-48
• 3.2.1 小鼠睾丸中有褪黑素受体MT1、MT2的表达40-41
• 3.2.2 褪黑素能够促进C18-4 细胞内抗氧化基因的表达41-42
• 3.2.3 褪黑素能够有效的挽救白消安注射1周后小鼠曲细精管中的细胞42-43
• 3.2.4 褪黑素能够有效的挽救白消安注射2周后小鼠曲细精管中的细胞43-44
• 3.2.5 褪黑素不能够有效的挽救白消安注射3周后小鼠曲细精管中的细胞44-45
• 3.2.6 褪黑素能够有效的缓解白消安的细胞毒性45-46
• 3.2.7 褪黑素能够抑制P38信号通路从而缓解白消安所导致的细胞凋亡46-48
• 3.3 讨论48
• 3.4 小结48-49
• 第四章 褪黑素能够通过保护线粒体抑制ROS从而缓解白消安的细胞毒性49-59
• 4.1 材料和方法49-52
• 4.1.1 实验材料49
• 4.1.2 实验试剂49
• 4.1.3 实验仪器49
• 4.1.4 主要实验溶液的配制49-50
• 4.1.5 褪黑素、白消安处理后细胞内活性氧检测50
• 4.1.6 褪黑素、白消安处理后细胞内GSH/ GSSG检测50-51
• 4.1.7 褪黑素、白消安处理后细胞内线粒体膜电位检测51-52
• 4.1.9 稳定性分析52
• 4.2 结果52-57
• 4.2.1 褪黑素能够有效的缓解白消安所导致的细胞内ROS积累52-53
• 4.2.2 褪黑素能够有效地保护细胞内GSH的平衡53-54
• 4.2.3 褪黑素能够有效的保护线粒体膜电位平衡54
• 4.2.4 褪黑素通过提高SIRT1、MnSOD的表达抑制白消安毒性54-57
• 4.3 讨论57-58
• 4.4 小结58-59
• 结论59
• 创新点59
• 进一步研究课题59-60
• 参考文献60-67
• 附录67-71
• 缩略词71-72
• 致谢72-73
• 作者简介及攻读硕士学位期间的主要研究成果73

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