骨髓间充质干细胞抑制大鼠慢性前列腺炎作用机制的研究

发布时间：2017-08-15 16:37

  本文关键词：骨髓间充质干细胞抑制大鼠慢性前列腺炎作用机制的研究

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【摘要】：一、背景世界范围内约90%男性在其生命全过程中均存在隐性或显性泌尿系统炎性疾病,前列腺炎(prostatitis)是泌尿系统最常见的感染性疾病。在NIH对前列腺炎的分型中,病因较明确的为急性细菌性前列腺炎(Ⅰ型)和慢性细菌性前列腺炎(Ⅱ型)。历年研究显示,前列腺炎与良性前列腺增生及恶性病变密切相关,因此其防治越来越受到重视。鉴于临床慢性前列腺炎病因学的复杂性及前列腺屏障的存在,目前临床上最核心的治疗手段--抗生素治疗,往往不能取得理想的效果,前列腺炎反复发作、迁延不愈情况比较普遍。早期我们在实验中观察到CBP大鼠模型的前列腺腺体内存在众多炎症细胞,这些细胞分泌的大量炎症因子,如TNF-α、IL-1β等,是炎症发生发展的使动因素。经抗生素治疗2-4周后,部分大鼠前列腺内未见细菌生长,但前列腺内仍存在炎症细胞,相关炎症因子表达水平升高,说明抗生素仅起到抵抗微生物的作用,对免疫炎症反应缺乏疗效,因此未来的治疗需要开发有效药物或新的治疗手段。骨髓间充质干细胞是一种具有快速增殖、低免疫原性、多向分化、免疫抑制及组织修复能力的干细胞群。在过去的十余年中,BMSCs已应用于临床多种疾病治疗,最早出现在成骨不连的治疗中,随后在溶酶体贮积症、移植物抗宿主病、Crohn肠炎的治疗中也得到应用。早期研究表明MSCs通过抑制T细胞、B细胞、抗原递呈细胞增殖以及抑制促炎因子的产生而发挥抑制炎症反应的作用。近年来,MSCs在免疫抑制实验研究中也取得了较多新进展,Elman等在小鼠革兰氏阴性菌败血症实验中应用MSCs治疗,发现MSCs通过增强单核细胞噬菌活性而提高了小鼠生存率。Nemeth等发现向支气管哮喘大鼠静脉内注射BMSCs,这些细胞1小时后可特异性聚集在肺内炎症部位,通过分泌TGF-β降低了支气管灌洗液中Th2相关炎症因子及血清中Ig G1、Ig E的水平,从而减轻了免疫炎症反应。近期研究发现MSCs通过自身分泌的细胞因子及抗菌肽可直接抑制并清除细菌。Gupta、Lee、Krasnodembakaya等在MSCs治疗大肠杆菌诱导的肺炎实验研究中发现,通过向气管内滴注MSCs,可减轻肺部炎症反应,其作用机制为MSCs分泌角质细胞生长因子(KGF),增强了单核细胞噬菌能力,以及mscs分泌抗菌肽ll-37、载脂蛋白-2直接清除了大肠杆菌。国内学者在研究中也发现mscs通过分泌具有生物活性的微泡,转运kgfmrna到肺泡上皮而起到抑制肺部炎症反应的作用。上述研究充分证明bmsc对炎症性疾病具有较好的治疗效应。而bmscs是否能够抑制慢性前列腺炎目前尚不清楚。超声波不仅在临床诊断中被广泛应用,而且因其作为一种能量,具有“机械效应、热效应、空化效应”,在疾病治疗中也得到应用。当其发生空化效应时,冲击波等机械能的作用可以致使细胞之间存在的紧密连接断开。超声造影剂微泡进入静脉后,在超声波辐照影响下出现“内爆”现象,从而增强超声空化作用,进而可在血管内皮细胞间开放空隙。课题组早期实验成果已证实血-前列腺屏障阻碍药物进入前列腺间质内,而毛细血管内皮细胞间的紧密连接参与血-前列腺屏障构成。血-前列腺屏障同样也阻碍bmscs进入前列腺内,影响其抑炎作用。超声复合微泡是否能破坏这一屏障,进而促进bmscs向前列腺归巢有待进一步研究。二、目的:利用贴壁培养法分离、培养及扩增bmscs;通过超声引导下注射大肠埃希菌建立大鼠cbp模型;通过超声复合微泡促进bmscs向前列腺归巢,发挥其抑制炎症反应的作用。本研究有望拓宽对bmscs免疫调节机制的认识,为临床慢性前列腺炎的防治提供新的策略。三、方法:1.取3周雄性sd大鼠双侧股骨骨髓,采用贴壁培养法分离、培养及扩增bmscs,进行细胞表面标记物及诱导分化鉴定。gfp-luc腺病毒转染、标记bmscs,并检测荧光标记后细胞的增殖特性。2.超声引导下向220-250gsd大鼠前列腺内注射e.coli,建立大鼠cbp模型,通过细菌培养法检测建模成功性,观察建模后大鼠生存情况及生物学行为改变情况。3.尾静脉输注bmscs,利用超声复合微泡促进bmscs向前列腺归巢,并检测相关炎症因子改变情况,观察病理形态的改善。四、结果:1.分离、培养的bmscs,具有成骨及成脂分化潜能;荧光标记后的bmscs未改变增殖活性。2.超声引导注射法成功建立大鼠CBP模型,经检测前列腺内有大肠埃希菌生长,建模后大鼠出现尿频症状,未发现死亡现象。3.超声复合微泡促进BMSCs向前列腺归巢。经静脉输注BMSCs2周后,前列腺组织病理学观察见CBP组、CBP+BMSCs组、CBP+MEUS组前列腺管腔上皮层增生,层次增加,形状呈瘤样,可见上皮细胞坏死;间质内见大量炎症细胞浸润,大量纤维组织增生,与正常对照组比较有显著差异(P0.01);CBP+MEUS+BMSCs组见前列腺管腔结构较完整,间质内炎症细胞少量浸润,纤维组织增生程度较CBP组显著减轻(P0.01)。RT-PCR检测结果示TNF-α及IL-1βmRNA含量在CBP组、CBP+BMSCs组、CBP+MEUS组表达显著高于正常对照组和CBP+MEUS+BMSCs组(P0.05)。ELISA分析显示CBP组、CBP+BMSCs组、CBP+MEUS组炎症因子TNF-α和IL-1β含量均显著高于正常对照组和CBP+MEUS+BMSCs组(P0.01)。而CBP+MEUS+BMSCs组与正常对照组比较,TNF-α和IL-1β含量增高无统计学差异(P0.05)。五、结论:1.利用贴壁培养法可成功于体外分离、培养BMSCs,为下一步实验奠定基础。2.超声引导注射细菌建立大鼠慢性细菌性前列腺炎模型较传统方法比较,创伤小,并发症少,死亡率低。3.静脉输注的BMSCs在超声复合微泡协助下可向前列腺聚集,并发挥免疫调节作用,抑制前列腺内炎症反应,相关机制有待进一步研究。
【关键词】：骨髓 间充质干细胞 大鼠 超声 微泡 慢性前列腺炎 大肠杆菌 炎症因子 TNF-α IL-1β
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R697.33
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及标记14-22
• 2.1 材料和方法14-18
• 2.2 结果18-20
• 2.3 讨论20-21
• 2.4 小结21-22
• 第三章 大鼠慢性前列腺炎模型的建立22-27
• 3.1 材料和方法22-24
• 3.2 结果24-25
• 3.3 讨论25-26
• 3.4 小结26-27
• 第四章 骨髓间充质干细胞对大鼠慢性前列腺炎治疗及机制的研究27-41
• 4.1 材料与方法27-33
• 4.2 结果33-38
• 4.3 讨论38-40
• 4.4 小结40-41
• 全文结论41-42
• 参考文献42-46
• 文献综述 间充质干细胞免疫调节特性的优点及应用46-60
• 参考文献52-60
• 在读硕士期间发表的论文60-61
• 致谢61

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