CRISP2蛋白在弱精症精液精子中表达下调的分子机制及其临床意义

发布时间：2017-08-19 03:30

  本文关键词：CRISP2蛋白在弱精症精液精子中表达下调的分子机制及其临床意义

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【摘要】：不孕不育已逐渐成为全球性的健康问题,影响着全球15%的育龄夫妇。这些不孕不育夫妇中男性因素占50%,而获得性和先天性精子异常是男性不育的重要因素。作为精子质量异常最常见的类型,弱精症是引起男性不育主要的因素之一[4]。根据WHO第五版诊断标准,弱精症是指精液参数中前向运动的精子率小于32%的病症,其病因和病理复杂多样。许多假说被认为和弱精症相关,如先天性或获得性泌尿生殖道异常,内分泌紊乱,阴囊温度异常(精索静脉曲张),泌尿生殖道感染,睾丸损伤或病变,抗精子抗体或遗传变异等,但其确切发病机制目前尚不清楚。近年来许多研究已经开始关注于弱精症发生发展的分子机制。一些差异表达基因,诸如Tekt2, DNAI1, DNAH5, DNAH11, Akap4, Sept和CRISP2 (cysteine-rich secretory protein 2),被认为与弱精症密切相关。其中CRISP2,属于CRISP/antigen5/pathogenesis (CAP)蛋白超家族中的CRISPs家族,因其特殊的定位和功能,引起了较为广泛的关注和研究。CRISP2蛋白,作为CRISPs家族中激素非依赖性,且唯一特异性表达于睾丸的蛋白,定位于精子顶体和尾部的外致密纤维鞘。在功能上,CRISP2蛋白通过RyR (ryanodine receptor)受体调控Ca2+离子通道的活性,参与精子鞭毛运动的调节、顶体反应和精卵融合等过程。基因芯片数据提示CRISP2与精子的发生以及男性不育密切相关。有研究表明CRISP2在弱精症精液精子中表达下调,并且动物牛中低水平的CRISP2与低的受孕率相关,以上数据均提示CRISP2参与弱精症的发生发展。因此,CRISP2在弱精症患者精液精子中表达下调的分子机制值得进一步探讨。基因的表达通常由遗传和表观遗传学共同调控DNA甲基化和micrRNAs (miRNA)调控作为表观遗传学中两项重要的调控机制,参与着许多生物学过程。目前研究表明异常的DNA甲基化与精子功能低下、少精密切相关；miRNA介导的基因调控参与精原细胞的诱导和分化,miRNA表达谱显示miRNAs广泛表达于哺乳动物的睾丸,鼠的生殖细胞以及人的精液精子中,提示miRNAs调控着精子发生的不同阶段。然而,目前仍不清楚DNA甲基化和miRNA调控是否参与调控弱精症CRISP2的低表达。在本研究中,我们将探讨弱精症精液精子中CRISP2的表达情况,CRISP2基因启动子区域甲基化的状态,以及microRNA 27b (miR-27b)调控CRISP2低表达的机理,同时阐明miR-27b和CRISP2在弱精症、男性不育的临床意义。本研究将为弱精症的发生机制提供新的理论依据。方法和结果：1.弱精症精液精子中CRISP2蛋白表达下调,而CRISP2基因mRNA表达无差异。通过qRT-PCR和Western Blot技术检测48例弱精症和42例正常精液精子中CRISP2基因的mRNA和蛋白表达水平,发现弱精症精液精子中CRISP2基因的mRNA表达水平和正常组比较无差异(P=0.3854,图1-3),但CRISP2蛋白却表达下调(图1-4)。2.弱精症精液精子CRISP2基因启动子CpG岛未发现甲基化精液精子中包含着早期精子发生阶段的表观遗传学信息,可以通过检测精液精子中的甲基化状态来评估精子发生阶段的甲基化情况。通过甲基化特异和硫化测序性PCR (methylation-specific PCR, MSP)技术检测48例弱精症和42例正常精液精子中PCR (bisulfite-sequencing PCR, BSP)基因启动子CRISP2CpG岛甲基化状态,均未发现其启动子CpG岛存在甲基化(图2-2,2-3,2-4)。3.MiR-27b在弱精症精液精子中表达升高,并且可以通过靶向结合miR-27b基因3'-UTR并调控其表达。CRISP2调控作为表观遗传学的重要机制,可以通过与靶基因MiRNAs不完mRNA全互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致的翻译抑mRNA制或降解。据此,我们将探讨调控在弱精症中miRNA表达的作用。运CRISP2用生物信息学预测软件(包括miRWalk和miRDR, miRWalk数据库)Targetscan预测可能作用于基因3’-UTR的CRISP2和miRNAs——miR-27a, miR-27b, miR-502-3p, miR-510, miR-640(图3-3)。通过临床精液样本miR-767-5p技术初步筛选发现qRT-PCR在弱精症精液精子中高表达(P=0.0071,miR-27b图3-4A),随后在更大临床样本中亦证实在弱精症精液精子中高表达miR-27b(P=0.0013,图3-5),提示弱精症中和miR-27b密切相关。CRISP2为进一步探讨对miR-27b的靶向调控作用,我们构建搭载CRISP2基因3'-UTR的CRISP2荧光质粒,然后通过293T细胞体外共转染pEZX-MT05质粒和pEZX-MT05检测荧光信号强度。结果显示miR-27b mimic,可miR-27b以明显抑制搭载基因3'-UTR的CRISP2质粒的荧光强度,提示pEZX-MT05是miR-27b的靶基因,CRISP2可能通过抑制miR-27b参与弱精症的发CRISP2生。为了证实我们的结果,我们通过293T细胞分别体外转染miR-27b mimic、 inhibitor、 NC mimic或miR-27b mimic + CRISP2质粒,Western Blot技术检测CRISP2蛋白表达水平(图3-7),发现转染miR-27b mimic组CRISP2蛋白表达下调；转染miR-27b inhibitor组CRISP2蛋白表达升高；转染miR-27b mimic+ CRISP2质粒组,CRISP2蛋白恢复表达。此外,运用Spearman's相关性分析临床样本中miR-27b和CRISP2蛋白的相关性,发现精液精子中miR-27b的表达水平和CRISP2蛋白的表达水平呈负相关关系(r=-0.5039,P=0.0121；图3-8)。然而,没有证据显示miR-27b的表达水平和CRISP2基因的mRNA表达水平有相关性(P0.05,图3-9),这结果与前期研究中,CRISP2基因mRNA在两组样本(弱精症和正常精液精子)中表达无差异的结果相一致。综上所述,miR-27b可以直接调控CRISP2的表达。4. MiR-27b和CRISP2蛋白与前向运动精子率、形态正常精子率、不育密切相关。为了进一步分析miR-27b和CRISP2蛋白与弱精症的关系,我们分析了临床样本中miR-27b、CRISP2蛋白与前向运动精子率、形态正常精子率的相关性,发现在90位参与者(48例弱精症患者和42例正常志愿者)中miR-27b的表达水平和前向运动精子率呈负相关(r=-0.2745,P=0.0088；图4-1),和形态正常精子率呈负相关(r=-0.3397,P=0.0012；图4-2)。此外,在其中的24位参与者(12例弱精症患者和12例正常志愿者)中CRISP2蛋白的表达水平和前向运动精子率呈正相关(r=0.6697,P=0.0003；图4-3),和形态正常精子率呈正相关(r=0.5911,P=0.0024；图4-4)。最后,对90位参与者进行为期1年的婚育史随访调查研究。将63位有效回访者根据其miR-27b或CRISP2蛋白的表达水平分别分为miR-27b相对高表达组和miR-27b相对低表达组,以及CRISP2蛋白相对高表达组和CRISP2蛋白相对低表达组。分别计算各组的不育率,采用卡方检验或Fisher精确检验分析不同分组间不育率的差异(图4-5)。弱精症组的不育率明显高于正常对照组(32%,P=0.0038,表4-3),miR-27b相对高表达组的不育率明显高于miR-27b相对低表达组(P=0.0376,表4-4),CRISP2蛋白相对低表达组的不育率明显高于CRISP2蛋白相对高表达组(P=0.0335,表4-5),提示低表达的CRISP2蛋白、高表达的miR-27b与不育密切相关。MicroRNA是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA,通过与靶基因mRNA的3'-UTR不完全互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致mRNA的翻译抑制或降。精子miRNAs被认为参与调控精子发生的不同阶段。通过microRNAs芯片技术,分别在不同类型的精子发生受损的患者精液精子中发现许多差异表达miRNAs。特别地,Ji等发现在精索静脉曲张患者的精液精子中miR-15a能靶向结合HSPA1B并抑制其蛋白的表达,起着在精子成熟过程中对抗热应激反应的保护作用。目前普遍认为miRNAs是精子发生过程中的残留物,可以通过精子的miRNAs反应精子发生、精原细胞增殖、分裂过程的miRNAs情况；但亦有不同观点认为这些精子中的miRNAs可以在随后的受精过程中传递给卵细胞发挥调控功能。在我们的研究中,我们发现miR-27b可能调控CRISP2基因的表达,并通过生物信息学预测、临床样本筛选、荧光素酶报告基因检测系统、293T细胞体外转染miRNAs、精液样本中miR-27b和CRISP2相关性分析等一系列研究首次证实miR-27b可以通过直接靶向结合CRISP2基因3'-UTR并抑制其蛋白的表达。MiR-27b,在许多肿瘤中被认为是一种肿瘤抑制因子[63-65],可以抑制炎症反应、血管生成以及介导脂肪生成障碍、线粒体损伤。miRNA芯片数据显示miR-27b广泛表达于睾丸、卵巢以及受精卵,并且高表达于弱精症患者精液精子,提示在不同的精子发生过程中,miR-27b可能是一个重要的调节因子。研究报道,CRISP2广泛表达并参与精子发生、睾丸后精子成熟等不同阶段。许多研究显示CRISP2参与睾丸中Sertoli支持细胞间的粘附,特异性表达于睾丸,定位于精子的顶体和尾部,最终通过顶体反应或与顶体赤道段的再关联反应参与受精过程。特别地,基于基因芯片数据的分析提示CRISP2的异常表达与精子发生阻滞、功能缺失相关。更为有趣的是,尽管目前普遍认为精子在翻译水平是沉默的,但Yael Gur和Haim Breitbart证实哺乳动物精子在受精前发生了蛋白质的表达。这与我们观察到的结果相一致——弱精症精液精子中CRISP2基因mRNA表达水平无差异,而蛋白则表达下调。综上所述,CRISP2及其特异性调节因子miR-27b可能参与了精子发生、成熟、受精前等过程,尽管需要后续更多的研究数据支持。弱精症是指精子活力低下的病症,临床上常伴随着精子密度低下和精子畸形率升高。精子活力低下是导致男性不育的重要因素,而精子的活力和自然受孕率又密切相关;文献报道在动物牛精液精子中低表达的CRISP2将会引起低的受孕率。因此,为探讨miR-27b和CRISP2在弱精症、男性不育中的临床意义,我们分析了miR-27b和CRISP2与精液基本参数的相关性,并对所有参与者进行了为期1年的婚育史随访调查研究,发现精液精子中高表达的miR-27b、低表达的CRISP2蛋白和低的前向运动精子率、形态正常精子率密切相关,随访研究结果亦显示弱精症组的不育率高于正常对照组,高表达的miR-27b、低表达的CRISP2蛋白和高的不育率密切相关。尽管可能存在更多的miR-27b靶基因参与弱精症、男性不育的发生,但我们的研究揭示了在精子发生到受精前,miR-27b可能通过抑制CRISP2蛋白的表达,影响精子的活力和形态,进而参与弱精症、男性不育的发生发展。本研究阐明了弱精症精液精子中CRISP2蛋白表达下调的一种新机制,为男性不育的靶向性治疗以及男性避孕的可能提供了理论基础。结论：1.弱精症精液精子中CRISP2蛋白表达下降,而mRNA表达水平未见改变,提示CRISP2基因的表达可能不受转录水平的调控,并且低表达水平的CRISP2蛋白与弱精症关系更密切。2.弱精症和正常精液精子中均未发现CRISP2基因启动子CpG岛存在甲基化,提示DNA甲基化不参与弱精症中CRISP2表达的调控,CRISP2蛋白表达下调可能受转录后调控机制影响。3. miR-27b在弱精症精液精子中高表达,并且可以通过直接靶向结合CRISP2基因3’-UTR并抑制其蛋白的表达。4. miR-27b可能通过靶向结合CRISP2基因3’-UTR并抑制其蛋白的表达,影响精子的活力和形态,进而参与弱精症、男性不育的发生。
【关键词】：弱精症 富含半胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2) 男性不育 miR-27b
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R698.2
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-33
• References29-33
• 第一章 弱精症精液精子中CRISP2基因及蛋白的表达分析33-48
• 1 材料与方法33-42
• 2 结果42-45
• 3 讨论45-46
• 4 参考文献46-48
• 第二章 弱精症精液精子中CRISP2基因启动子CpG岛甲基化分析48-57
• 1 材料与方法48-52
• 2 结果52-55
• 3 讨论55
• 4 参考文献55-57
• 第三章 弱精症精液精子中差异表达的miR-27b在CRISP2基因表达中的调控作用分析57-73
• 1 材料与方法57-62
• 2 结果62-68
• 3 讨论68-70
• 4 参考文献70-73
• 第四章 弱精症精液精子中miR-27b和CRISP2在男性不育中的临床意义73-82
• 1 材料与方法73-74
• 2 结果74-80
• 3 讨论80-81
• 4 参考文献81-82
• 全文小结82-84
• 英文缩写注解84-85
• 攻读学位期间成果85-86
• 致谢86-87

【参考文献】

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1 周其赵;冯春琼;邹亚光;舒文;李铁求;李飞;刘存东;毛向明;;1层和2层梯度离心法分离精子的效果评价[J];中华男科学杂志;2010年03期

2 毛向明;邢荣威;景晓玮;周其赵;余庆锋;郭文彬;武小强;褚庆军;冯春琼;;弱精子症相关基因的生物信息学研究[J];中华男科学杂志;2011年08期

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本文编号：698443