慢病毒介导RNA干扰UBE2C基因对前列腺癌细胞株作用的实验研究
发布时间:2017-08-30 08:14
本文关键词:慢病毒介导RNA干扰UBE2C基因对前列腺癌细胞株作用的实验研究
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【摘要】:目的探讨RNA干扰慢病毒重组颗粒(LV-sh RNA-UBE2C)介导人类泛素偶联酶E2C(ubiquitin-conjugating enzyme E2C,UBE2C)基因沉默后,对人前列腺癌细胞株UBE2C基因的表达、细胞增殖、细胞侵袭及迁移、克隆形成的影响。方法1.使用实时定量RT-PCR(real-time reverse transcription and polymerase Chain reaction,RT-PCR)检测UBE2Cm RNA在前列腺癌LNCap、PC3、DU145和C4-2四种细胞株的表达水平。以蛋白印迹(Western blot)技术检测UBE2C蛋白在LNCap、PC3、DU145、C4-2四种前列腺癌细胞株中的表达水平,并筛选实验用的细胞。2.根据RNAi的设计原则,进行设计合成特异性的靶向UBE2C的sh RNA表达载体(LV-sh RNA-UBE2C)及阴性对照组LV-sh RNA-NC,并且有美国Gene Copoeia公司包装合成慢病毒颗粒。3.将人前列腺癌PC3及DU145细胞株分别随机分为3组:LV-sh RNA-UBE2C实验组、LV-sh RNA-NC阴性对照组及空白对照组。实验组LV-sh RNA-UBE2C基因沉默组慢病毒颗粒进行感染PC3及DU145细胞细胞;LV-sh RNA-NC阴性对照组为对照慢病毒颗粒LV-sh RNA-NC感染PC3及DU145细胞;空白对照组为PC3及DU145细胞株常规的进行培养,不进行任何的处理。应用实时定量RT-PCR和蛋白印迹方法来检测UBE2C m RNA及蛋白的表达水平来评价慢病毒颗粒的干扰的效果。4.应用MTT法检测各组细胞在体外的增殖能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭及迁移能力,平板克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成,流式细胞技术(flow cytometry,FCM)分别检测各组细胞增殖情况。结果1.RT-PCR结果显示在LNCap、PC3、DU145和C4-2四种人前列腺癌细胞中UBE2Cm RNA均有表达,并且在PC3及DU145细胞内表达较高,其中在PC3细胞内表达最高。2.蛋白印迹结果显示人前列腺癌PC3及DU145细胞中UBE2C基因表达水平在四种细胞中的表达水平中显示较高,其中在PC3细胞内表达最高3.RT-PCR及蛋白印迹法结果显示:在PC3及DU145细胞中,实验组LV-sh RNA-UBE2C和阴性对照组LV-sh RNA-NC及空白对照组比较,UBE2C m RNA及蛋白的表达水平下调,差别显著(p0.05)。4.MTT法显示:LV-sh RNA-UBE2C组细胞在转染后48、72小时的OD490值均低于LV-sh RNA-NC阴性对照组、空白对照组,差别显著(p0.05)。5.平板克隆形成实验法显示:LV-sh RNA-UBE2C组的克隆形成能力明显低于LV-sh RNA-NC阴性对照组、空白对照组,LV-sh RNA-UBE2C实验组细胞生长明显受到抑制(p0.05)。6.Transwell实验显示LV-sh RNA-UBE2C组细胞迁移及侵袭能力较空白对照组和阴性对照组LV-sh RNA-NC下降(p0.05)。7.流式细胞技术显示:LV-sh RNA-UBE2C实验组较LV-sh RNA-NC阴性对照组、空白对照组G1期延长,S期缩短,差别显著(p0.05)。结论1.慢病毒介导的UBE2C基因干扰能稳定有效地表达于人前列腺癌细胞,筛选出能稳定干扰UBE2C基因表达的sh RNA序列和试验用的人前列腺癌PC3及DU145细胞株。2.UBE2C慢病毒干扰载体可有效沉默人前列腺癌PC3及DU145细胞UBE2C基因,下调人前列腺癌PC3及DU145细胞UBE2C基因的表达。针对UBE2C的sh RNA慢病毒颗粒能够有效的阻断人前列腺癌PC3及DU145细胞株中UBE2Cm RNA及蛋白的表达,并以此抑制细胞的生长增殖,下调细胞的侵袭、迁移能力,降低细胞的克隆形成能力。
【关键词】:慢病毒 RNA干扰 前列腺癌 细胞增殖 细胞侵袭
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R737.25
【目录】:
- 中文摘要4-6
- Abstract6-10
- 缩略语/符号说明10-12
- 前言12-15
- 研究现状、成果12-14
- 研究目的、方法14-15
- 一、慢病毒介导RNAi对人前列腺癌细胞UBE2C表达的影响15-40
- 1 材料和方法15-32
- 1.1 主要仪器及试剂15-19
- 1.2 实验方法19-32
- 1.2.1 慢病毒颗粒构建、转化、重组19-21
- 1.2.2 细胞培养及相关操作21-22
- 1.2.3.实时定量RT-PCR检测22-25
- 1.2.4.蛋白印迹法检测25-29
- 1.2.5.慢病毒液的滴度测定29-30
- 1.2.6.细胞转染30-32
- 1.2.7.统计学分析32
- 2 结果32-36
- 3 讨论36-39
- 4 小结39-40
- 二、下调UBE2C表达影响人前列腺癌细胞株生物学行为40-53
- 1 材料和方法40-44
- 1.1 材料40
- 1.2 主要试剂40
- 1.3 方法40-44
- 1.3.1 细胞培养相关操作40
- 1.3.2 细胞转染40-41
- 1.3.3 慢病毒转染41
- 1.3.4 MTT法分析细胞增殖41-42
- 1.3.5 平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成42-43
- 1.3.6 Transwell小室细胞迁移实验43
- 1.3.7 Transwell小室细胞侵袭实验43-44
- 1.3.8 流式细胞术检测细胞周期44
- 1.3.9 统计学分析44
- 2 结果44-50
- 3 讨论50-52
- 4 小结52-53
- 全文结论53-54
- 参考文献54-57
- 发表论文57-58
- 综述 UBE2C与肿瘤关系的研究进展58-64
- 综述发表文献62-64
- 致谢64-65
- 个人简历65
本文编号:758195
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