二甲双胍通过COX2-PGE2-STAT3抑制膀胱癌干细胞的增殖以及膀胱癌的进展

发布时间：2017-09-01 00:41

  本文关键词：二甲双胍通过COX2-PGE2-STAT3抑制膀胱癌干细胞的增殖以及膀胱癌的进展

  更多相关文章： 二甲双胍 肿瘤干细胞 环氧化酶2 前列腺素E2 STAT3信号通路

【摘要】：目的肿瘤干细胞已经证实与肿瘤的发生、分化、复发、转移、化学治疗药物的抵抗有关。二甲双胍是最常见的降血糖药物,已经证实可通过不同的通路起到抗肿瘤的作用,但是二甲双胍抑制膀胱癌干细胞的作用还不清楚。我们希望通过对膀胱癌动物模型和细胞模型的研究,探究二甲双胍对膀胱癌干细胞增殖以及膀胱癌进展的影响。方法1.大鼠分为三组:对照组(经尿道灌注柠檬酸钠缓冲液+普通饮水)、MNU组(经尿道灌注MNU+普通饮水)、MET组(经尿道灌注MNU+1g/L二甲双胍作为饮水),每三周灌注2.5mg MNU一次,饮水每日更换。三组分别于第三周(30只)、第六周(26只)、第十二周(44只)处死相应分组的SD大鼠,测量他们的体重、血糖,留取膀胱组织,膀胱组织用10%的福尔马林固定24小时,然后进行石蜡包埋。石蜡组织块连续切片,随后进行常规HE染色;分别进行抗Ki-67抗体、抗Bcl-2抗体、抗CK20抗体、抗CK14抗体、抗OCT3/4抗体、抗COX2抗体、抗p-STAT3抗体免疫组化染色。2.采用MTT法研究20 mM二甲双胍对T24、RT4膀胱癌细胞增殖的影响;采用Western blot法研究0mM、1mM、5mM、10 mM、20 mM二甲双胍对T24、RT4膀胱癌细胞的Bcl-2、Cyclin D1、AMPK、p-AMPK蛋白的影响;流式细胞学研究0mM、1mM、5m M、10 mM、20 m M二甲双胍对T24膀胱癌细胞周期及凋亡的影响。3.采用ELISA法检测0mM、1m M、5mM、10mM、20mM二甲双胍对T24膀胱癌细胞生成PGE2的影响;采用Western blot法检测0m M、1m M、5mM、10 m M、20 mM二甲双胍、塞来昔布、外源性PGE2以及si COX2处理T24膀胱癌细胞后,对COX2、p-STAT3、STAT3、CK14、OCT3/4蛋白表达的影响。结果1.第三周膀胱组织HE染色对照组无异常,MNU组轻度非典型增生与MET组比较无统计学差异(MNU组10只大鼠vs MET组10只大鼠:24 vs 28,P=0.466),MNU组的中、重度非典型增生比MET组显著增多(MNU组10只大鼠vs MET组10只大鼠:36vs10,p=0.007)。第六周膀胱组织he染色,对照组未见异常,mnu组轻度非典型增生比met组少(mnu组8只大鼠vsmet组8只大鼠:15vs29,p=0.026),mnu组的中、重度非典型增生比met组显著增多(mnu组8只大鼠vsmet组8只大鼠30vs5,p=0.02),且mnu组有三处cis,而met组未发现cis。第十二周膀胱组织he染色,对照组未见异常,mnu组膀胱乳头状癌比met组少(mnu组14只大鼠vsmet组20只大鼠:19vs53,p=0.03),mnu组的膀胱浸润性癌比met组显著增多(mnu组14只大鼠vsmet组20只大鼠49vs46,p=0.034)。2.t24、rt4膀胱癌细胞给予20mm的二甲双胍处理、对照组不作特殊处理,分别处理5天,mtt检测细胞活性,处理组较未处理组细胞活性下降、生长缓慢,且在处理24小时后开始出现抑制细胞生长的效应。一磷酸腺苷蛋白激活酶(ampk)已经确认是二甲双胍的分子靶点,t24细胞不同浓度的二甲双胍处理后westernblot分析其p-ampk蛋白表达增加而总的ampk蛋白无明显变化,t24、rt4细胞bcl-2、cyclind1蛋白表达降低且表现出剂量依赖性。t24膀胱癌细胞不加血清饥饿24小时后分别给予0mm、1mm、5mm、10mm、20mm二甲双胍处理24小时,进行周期和凋亡分析,二甲双胍处理组g1/s期细胞数增加,而且凋亡细胞的数量增多。对第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱组织进行抗ki-67抗体、抗bcl-2抗体的免疫组化染色结果,二甲双胍处理组不仅染色强度较未处理组弱而且染色细胞数也较少。3.为了研究二甲双胍是否对不同的祖细胞可以发挥不同的效应,我们研究了两种干细胞标志物即ck14和oct3/4。我们对第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱组织进行抗ck14抗体、抗oct3/4抗体的免疫组化染色结果,二甲双胍处理组染色强度较未处理组弱,染色阳性细胞数也较未处理组少,同时ck20染色强度增加和阳性的细胞数增加。这就表明二甲双胍可以选择性抑制浸润性病变而对乳头状病变无影响。这些数据说明二甲双胍可抑制基底细胞的增殖从而抑制早期原位癌、浸润性肿瘤的进展。4.为了探讨研究二甲双胍抑制ck14、oct3/4阳性细胞增殖的机制,我们研究二甲双胍在pge2合成酶cox2中的作用。对第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱组织进行抗cox2抗体的免疫组化染色结果,在每个时间点,二甲双胍处理组染色强度都较未处理组弱,染色阳性细胞数也较未处理组少。t24膀胱癌细胞给予0mm、1mm、5mm、10mm、20mm二甲双胍处理24小时后进行westernblot分析cox2蛋白,结果表明二甲双胍剂量性依赖地抑制cox2的表达,与动物实验的结果相一致。pge2作为cox2的催化产物,elisa结果也证实了:二甲双胍确实可以抑制pge2的合成。有研究表明,在直肠癌中pge2可以调控jak/stat3信号通路;同时也有研究证实膀胱癌中STAT3不仅可以调控CK14阳性干细胞的增殖,也可以导致浸润性膀胱癌的进展。因而我们推测二甲双胍抑制膀胱癌的进展是通过COX2/PGE2/STAT3这一通路。体内原位膀胱癌SD大鼠模型中,P-STAT3的免疫组化结果证实了二甲双胍抑制STAT3的活化。同样,体外细胞实验,二甲双胍剂量依赖性地抑制了p-STAT3蛋白而总STAT3蛋白无变化,与此同时,也下调了CK14和OCT3/4这两个干性指标。这些结果暗示了:二甲双胍通过COX2/STAT3通路抑制膀胱癌的进展。为证实这一通路,我们用COX2特异性的抑制剂塞来昔布(或二甲双胍)来处理T24细胞,Western blot结果证实塞来昔布特异性地抑制COX2后,相应的P-STAT3、CK14和OCT3/4等下游蛋白水平也被下调与二甲双胍的效应一致。进一步我们用si RNA技术敲低COX2,si COX2-1、siCOX 2-3能敲低COX2从而抑制p-STAT3、CK14、OCT3/4蛋白的表达,总的STAT3蛋白未见改变,其中siCOX 2-2未敲低COX2的原因不太清楚。为研究PGE2在这个通路中的影响,我们给予外源性的PGE2处理T24膀胱癌细胞,Western blot结构表明p-STAT3、CK14、OCT3/4蛋白的表达升高,因此,这些结果表明二甲双胍能通过下调COX2,从而抑制COX2/PGE2/STAT3信号通路来实现抑制膀胱癌CK14+干细胞的增殖。结论1.二甲双胍虽然不能抑制原位膀胱癌模型膀胱肿瘤的形成,但能减缓浸润性膀胱癌形成的时间以及减少浸润性病变的数量;2.二甲双胍可以抑制膀胱癌干细胞的增殖、促进膀胱癌干细胞的凋亡;3.二甲双胍可下调COX2和PGE2达到抑制STAT3的磷酸化和活化。综上所诉二甲双胍通过COX2/PGE2/STAT3抑制膀胱癌干细胞的增殖以及膀胱癌的进展
【关键词】：二甲双胍 肿瘤干细胞 环氧化酶2 前列腺素E2 STAT3信号通路
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 二甲双胍抑制SD雌性大鼠原位膀胱癌模型的进展15-27
• 2.1 材料和方法15-19
• 2.2 结果19-26
• 2.3 讨论26-27
• 第三章 二甲双胍通过COX2/PGE2/STAT3信号通路抑制膀胱癌干细胞体外增殖和促进细胞凋亡27-39
• 3.1 材料和方法27-34
• 3.2 结果34-37
• 3.3 讨论37-39
• 全文结论39-40
• 参考文献40-45
• 文献综述 膀胱癌的起源45-53
• 参考文献50-53
• 攻读硕士学位期间发表的文章53-54
• 致谢54

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 成杰;蔡明江;贾永莉;尹照华;;二甲双胍的应用现状调查[J];实用糖尿病杂志;2005年06期

2 潘明政;;二甲双胍伤肾吗[J];医药与保健;2008年11期

3 衡先培;;二甲双胍的临床应用[J];中国乡村医药;2006年02期

4 H.Mehnert,邵丙扬;二甲双胍在糖尿病治疗中的地位[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;1999年02期

5 王煜;;二甲双胍的临床应用疗效评析[J];药品评价;2012年10期

6 伍晓玲,梁常禧,罗碧云;诺和灵与甲双胍强化治疗2型糖尿病22例效果观察及护理[J];右江民族医学院学报;2002年04期

7 陈凌;二甲双胍的临床应用体会[J];山东医药;1994年06期

8 赵红玲;张雪坤;;二甲双胍的降糖外作用研究进展[J];医学理论与实践;2011年16期

9 ;古老的药物 崭新的应用[J];科技传播;2011年17期

10 郑媛媛;;甲双胍通过改变微生物叶酸和甲硫氨酸的代谢延缓秀丽隐杆线虫的衰老[J];中国病理生理杂志;2013年10期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 侯沃霖;张丹丹;刘芳;陆蔚;殷峻;李鸣;卢逢娣;包玉倩;贾伟平;;二甲双胍可降低女性2型糖尿病患者的血清CA125水平[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

2 朱云云;冯怡;沈岚;王彬;阮克峰;从文娟;;二甲双胍预防2型糖尿病的尿液代谢组学研究[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年

3 安慧杰;魏蕊;杨进;王广;洪天配;;二甲双胍促进血管内皮一氧化氮合酶复偶联的作用及其机制[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

4 杜云波;赵英萍;;二甲双胍致糖尿病乳酸性酸中毒12例的临床分析[A];中国病理生理学会危重病医学专业委员会第八届全国大会暨中华呼吸病学会呼吸生理和重症监护学组年会论文集[C];2008年

5 郭力;李显筑;王梅;;二甲双胍对糖尿病患者心血管危险因素的影响及其机理探讨[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年

6 张丹丹;刘芳;唐峻岭;郑泰山;陆慧娟;谢君;卢逢娣;包玉倩;贾伟平;;2型糖尿病患者血清CA199水平的性别差异及二甲双胍对其影响[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

7 吴加华;周嘉强;;二甲双胍对葡萄糖-6-磷酸酶基因表达的抑制作用及其机制[A];2013年（第三届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年

8 吴加华;周嘉强;;二甲双胍对葡萄糖-6-磷酸酶基因表达的抑制作用及其机制[A];中国药理学与毒理学杂志(2013年6月第27卷第3期)[C];2013年

9 王述进;;二甲双胍对2型糖尿病患者血清c反应蛋白水平的影响[A];全国首届代谢综合征的基础与临床专题学术会议论文汇编[C];2004年

10 安慧杰;刘金波;柯静;王广;洪天配;;二甲双胍逆转波动性高糖诱导的内皮细胞功能失调的机制研究[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 秦家珍;服二甲双胍监测肾功能[N];医药养生保健报;2007年

2 健康时报实习记者 井超;缓释降糖药别掰开吃[N];健康时报;2009年

3 钱荣立;二甲双胍不是减肥药[N];健康报;2003年

4 王欣;二甲双胍的临床新用[N];医药养生保健报;2006年

5 彦珉;二甲双胍的“后现代生活”[N];医药经济报;2008年

6 徐述湘;50年应用 二甲双胍成为降糖经典药物[N];中国医药报;2008年

7 章潮忠 袁克俭;“老当益壮”的二甲双胍[N];健康报;2006年

8 韩咏霞;五种情况慎用二甲双胍[N];医药经济报;2008年

9 裘影萍;特殊人群慎服二甲双胍[N];医药经济报;2009年

10 健康时报记者 戴志悦;服二甲双胍别喝酸奶[N];健康时报;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 姚新明;二甲双胍对糖尿病肾脏疾病的保护作用及机制探讨[D];安徽医科大学;2014年

2 许国顺;二甲双胍对造血免疫系统辐射损伤防护作用及分子机制研究[D];北京协和医学院;2013年

3 汪莉;二甲双胍对奥氮平致精神分裂症体重增加者肝脏脂肪含量的影响[D];第二军医大学;2015年

4 刘瑛;二甲双胍通过mTOR信号通路对Hacat角质形成细胞增殖的影响[D];山东大学;2015年

5 赵彬;二甲双胍调节脑胶质瘤周围脑水肿的机制研究[D];吉林大学;2016年

6 韦德华;p53、线粒体基因多态性与二甲双胍辅助卵巢癌化疗增敏关系研究[D];郑州大学;2016年

7 张艳飞;二甲双胍对2型糖尿病合并结直肠癌患者预后的影响及其机制[D];南方医科大学;2013年

8 张涛;二甲双胍对膀胱癌的抑制作用及其机制研究[D];山东大学;2014年

9 李伟宁;二甲双胍对HaCaT细胞增殖信号通路及豚鼠耳银屑病模型影响研究[D];山东大学;2014年

10 黄为;二甲双胍对胆管癌细胞株RBE的作用及其机制研究[D];中南大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 许斌斌;二甲双胍、塞来昔布对小鼠结直肠肿瘤预防作用的研究[D];福建医科大学;2015年

2 王槐文;二甲双胍联合放疗诱导结直肠癌细胞凋亡的分子机制研究[D];福建医科大学;2015年

3 刘佳;二甲双胍对糖尿病大鼠的骨保护作用与内质网应激的关系[D];福建医科大学;2015年

4 王静璐;二甲双胍通过调节EGFR信号通路抑制子宫内膜癌细胞增殖的研究[D];郑州大学;2015年

5 史明星;二甲双胍对子宫内膜癌细胞系脂联素表达的影响[D];郑州大学;2015年

6 彭铮;二甲双胍通过p38MAPK信号通路抑制ERCC1基因逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药性[D];郑州大学;2015年

7 王涛;二甲双胍对人食管癌细胞系KYSE450增殖和凋亡的影响及其机制[D];郑州大学;2015年

8 马彦荣;基于Octs和Mate1分别探究阿替洛尔和美托洛尔对大鼠二甲双胍药动学的影响[D];兰州大学;2015年

9 孟祥丽;二甲双胍增加食管鳞癌对顺铂化疗敏感性的机制研究[D];新乡医学院;2015年

10 丁跃;二甲双胍对人网膜脂肪细胞中v-SNAREs家族表达的影响[D];山西医科大学;2015年

，

本文编号：768937