高糖对小球系膜细胞生物钟基因表达的影响及机制探讨

发布时间：2017-09-04 22:46

  本文关键词：高糖对小球系膜细胞生物钟基因表达的影响及机制探讨

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【摘要】：目的:昼夜节律(Circadian rhythm)是自然界最普遍的自然现象之一,昼夜节律生物钟(Circadian clock)就是设定并调控机体出现这种昼夜节律的系统,是一种以近似24小时为周期的昼夜节律振荡器(Circadian oscillator)。生物钟与太阳光周期变化、物质代谢和能量摄取同步。血糖作为物质代谢和能量摄取的重要环节及组成部分,大量动物实验及临床研究证实生物钟基因表达水平高低与血糖水平密切相关,生物钟基因的缺失可导致胰岛素分泌减少、胰岛素分泌节律紊乱,生物钟节律紊乱成为糖尿病发病的重要危险因素。但目前尚无研究系统探讨高糖对生物钟基因的影响及生物钟基因在糖尿病并发症发病中的作用及机制,故本研究通过观察小鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)生物钟基因在不同浓度高糖及在活性氧(Reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acctyl-L-cystcinc,NAC)干预下的表达变化,同时检测小鼠肾小球系膜细胞培养上清液中炎症因子表达变化,旨在探讨高糖对肾小球系膜8个生物钟基因表达的影响及作用机制。方法:1.细胞培养及实验分组:体外培养小鼠肾小球系膜细胞,以不同浓度高糖作为刺激因素,活性氧抑制剂NAC作为ROS阻断剂干预高糖作用,分别设为以下4组:(1)正常对照组(normal control group,NC组):培养基含5.6mmol/L葡萄糖;(2)渗透压对照组(osmotic pressure group,op组):培养基含5.6mmol/l葡萄糖+24.4mmol/l甘露醇(渗透压约等于30mmol/l高糖组);(3)不同浓度高糖组(highglucosegroup,hg组):培养基分别含10mmol/l葡萄糖(hg1组)、20mmol/l葡萄糖(hg2组)、30mmol/l葡萄糖(hg3组);(4)nac+高糖组(nac+hg组):表达变化最强浓度的高糖组预先加入10μmol/l活性氧抑制剂nac工作液作为干预因素,了解活性氧在高糖诱导的肾小球系膜细胞生物钟基因改变中的作用。2.检测方法:(1)各组小鼠肾小球系膜细胞适时随机分别加入不同作用物培养24小时后用rt-pcr法检测细胞中8个生物钟基因clock,bmal1,rev-erbα,per1,per2,per3,cry1,cry2mrna表达水平变化;(2)各组小鼠肾小球系膜细胞适时随机分别加入作用物培养24小时后装载2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐探针(2',7'-dichlorofluorescindiacetate,dcfh-da),用分光光度计检测细胞内ros水平变化;(3)各组小鼠肾小球系膜细胞适时随机分别加入作用物培养24小时后收集细胞培养液,离心后取上清液用elisa法检测细胞培养上清液中炎症因子白介素-6(interleukin-6,il-6)及c-c趋化因子配体-2(c-cchemokineligand2,ccl-2;又称为单核细胞趋化蛋白-1,monocytechemotacticprotein1,mcp-1)的表达变化。3.统计学分析:应用统计软件spss20.0进行数据分析,数据用均数±标准差(xˉ±s)表示,组内比较采用方差齐性检验,各组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较用lsd-t法,我们定义p0.05为差异具有统计学意义。结果:1.与正常对照组相比,高糖组小鼠肾小球系膜细胞生物钟基因CLOCK,BMAL1,REV-ERBα,Per1,Per2,Per3,Cry1,Cry2 mRNA表达水平均增加(P0.05),其中CLOCK,BMAL1,REV-ERBα,Per1,Per2,Per3,Cry2 mRNA表达增加呈浓度依赖性;同时,与正常对照组相比,高糖组小鼠肾小球系膜细胞内ROS水平及细胞培养上清液中IL-6及CCL-2表达水平均呈浓度依赖性增加(P0.05)。2.与高糖组相比,预先加入NAC干预高糖氧化应激作用后可阻止高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞CLOCK,BMAL1,REV-ERBα,Per1,Per2,Per3,Cry1,Cry2 mRNA高表达(P0.05),加入NAC干预高糖作用后同样能降低小鼠肾小球系膜细胞内ROS水平及细胞培养上清液中IL-6、CCL-2表达水平(P0.05)。结论:高糖通过氧化应激机制上调小鼠肾小球系膜细胞生物钟基因CLOCK,BMAL1,REV-ERBα,Per1,Per2,Per3,Cry1,Cry2的表达,可能参与了糖尿病肾病炎症反应的发生。
【关键词】：糖尿病 生物钟 氧化应激 炎性介质
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-16
• 材料与方法16-30
• 结果30-41
• 讨论41-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 英文缩略词表52-53
• 致谢53-54
• 个人撰写、发表文章54-55
• 生物钟基因与糖尿病 综述55-66
• 参考文献62-66

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本文编号：794306