内质网应激在前列腺素E2受体1、3亚型参与TGF-β1诱导的肾脏纤维化过程中的作用
本文关键词：内质网应激在前列腺素E2受体1、3亚型参与TGF-β1诱导的肾脏纤维化过程中的作用
更多相关文章： EP1受体基因缺陷 EP3受体基因缺陷 系膜细胞 转化生长因子β1 内质网应激 ERK信号通路 5/6肾切除模型
【摘要】：目的探讨内质网应激在前列腺素E2受体亚型1(EP1)和亚型3(EP3)参与转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的小鼠肾小球系膜细胞损伤和肾脏纤维化的作用及可能机制。方法体外研究1.体外原代培养野生型(WT)、EP1-/-及EP3-/-小鼠肾小球系膜细胞,并采用逆转录PCR和western blot的方法对基因敲除小鼠进行鉴定。2.分组:EP1分组(1)EP1基因敲除小鼠肾小球MCs分组:(1)WT组;(2)WT+TGF-β1组;(3)EP1-/-组;(4)EP1-/-+TGF-β1组;(2)加入EP1受体激动剂(EP1 agonist)MCs分组:(1)WT组;(2)WT+TGF-β1组;(3)EP1 agonist组;(4)EP1 agonist(10μM)+TGF-β1组;(3)加入EP1受体拮抗剂(SC-19220)MCs分组:(1)WT组;(2)WT+TGF-β1组;(3)SC-19220组;(4)SC-19220(1μM)+TGF-β1组。EP3分组(1)EP3基因敲除小鼠肾小球MCs分组:(1)WT组;(2)WT+TGF-β1组;(3)EP3-/-组;(4)EP3-/-+TGF-β1组;(2)加入EP3受体激动剂(Sulprostone)MCs分组:(1)WT组;(2)WT+TGF-β1组;(3)Sulprostone组;(4)Sulprostone(10μM)+TGF-β1组;(3)加入EP3受体拮抗剂(L-798106)MCs分组:(1)WT组;(2)WT+TGF-β1组;(3)L-798106组;(4)L-798106(1μM)+TGF-β1组。3.westernblot法检测各组细胞fn,ctgf,grp78,trpc1及细胞外信号调节激酶1/2(erk1/2)活性变化。4.real-timepcr法检测各组细胞fn,ctgf,grp78,trpc1mrna的表达。5.mtt法检测系膜细胞增殖程度。6.流式细胞仪检测细胞凋亡。体内研究1.建立5/6肾切除模型。2.动物分组:ep1分组(1)wtcon组(野生型小鼠假手术组)(2)wtnx组(野生型小鼠手术组)(3)ep1-/-con组(ep1-/-基因型小鼠假手术组)(4)ep1-/-nx组(ep1-/-基因型小鼠手术组)。ep3分组(1)wtcon组(野生型小鼠假手术组)(2)wtnx组(野生型小鼠手术组)(3)ep3-/-con组(ep3-/-基因型小鼠假手术组)(4)ep3-/-nx组(ep3-/-基因型小鼠手术组)。3.5/6肾切除建模约8周后,处死小鼠,留取尿液、采血作生化检测,肾组织作病理检测。4.观察肾脏病理变化,免疫组化检测各组肾组织有关指标变化。结果体外研究1.通过rt-pcr和westernblot方法,对ep1-/-和ep3-/-小鼠进行鉴定。2.与wt组比,tgf-β1组系膜细胞fn、ctgf、grp78、trpc1mrna和蛋白表达明显增加,erk1/2活性增加p0.05㖞。与wt+tgf-β1组相比,ep1-/-+tgf-β1组系膜细胞grp78、trpc1mrna和蛋白表达降低,erk1/2活性降低p0.05㖞;ep1agonist干预后,上调grp78、trpc1mrna和蛋白的表达,上调erk1/2活性p0.05㖞;而sc-19220干预后呈剂量依赖性抑制系膜细胞增殖,抑制grp78、trpc1mrna及蛋白表达,抑制erk1/2活性p0.05㖞。3.与wt组比,tgf-β1组系膜细胞grp78、trpc1mrna和蛋白表达明显增加,erk1/2活性增加p0.05㖞。与wt+tgf-β1组相比,ep3-/-+tgf-β1组系膜细胞grp78、trpc1mrna和蛋白表达降低,erk1/2活性降低p0.05㖞;sulprostone干预后,上调grp78、trpc1mrna和蛋白的表达,上调erk1/2活性p0.05㖞;而l-798106干预后呈剂量依赖性抑制系膜细胞增殖,抑制GRP78、TRPC1 mRNA及蛋白表达,抑制ERK1/2活性P0.05㖞。4.与对照组相比,TGF-β1组细胞增殖能力明显增强,差异有统计学意义(P0.05);与WT+TGF-β1组相比,EP3-/-组细胞增殖能力显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。5.与对照组比较,TGF-β1组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P0.05);与TGF-β1组比较,EP1-/-组、EP3-/-组细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。体内研究1.与各假手术组相比,5/6肾切除组尿渗透压明显降低,血肌酐、尿素氮明显升高,与EP1-/-、EP3-/-5/6肾切除组相比,野生型EP1+/+、EP3+/+5/6肾切除组血肌酐、尿素氮明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。2.病理切片显示5/6肾切除组较对照组有明显的肾间质纤维化,光镜下PAS染色可见:小鼠肾小管上皮细胞萎缩,胶原纤维化形成,弥漫性单核细胞、淋巴细胞浸润,并且随时间的延长,病理变化越严重,但EP1-/-5/6肾切除组与EP1+/+5/6肾切除组相比以上变化减轻,同样,EP3-/-5/6肾切除组与EP3+/+5/6肾切除组相比以上变化减轻。3.免疫组化发现EP1-/-nx小鼠肾小球CTGF、GRP78分布较EP1+/+nx小鼠有所减少,差异有统计学意义(P0.05),同样,EP3-/-nx小鼠肾小球CTGF、GRP78分布较EP3+/+nx小鼠减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论TGF-β1可诱导系膜细胞细胞外基质FN,CTGF的聚集,促进细胞的增殖,抑制EP1和EP3受体的表达可下调TGF-β1导致的FN、CTGF、GRP78、TRPC1及细胞调亡的表达,并抑制ERK磷酸化通路,减轻系膜细胞损伤,并且通过5/6肾切除模型研究进一步证实了体外实验的结果,推测其机制可能与抑制内质网应激通路有关。
【关键词】：EP1受体基因缺陷 EP3受体基因缺陷 系膜细胞 转化生长因子β1 内质网应激 ERK信号通路 5/6肾切除模型
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：
- 摘要6-9
- Abstract9-13
- 第一章 绪论13-18
- 1.1 课题来源、研究的目的和意义13-15
- 1.2 国内外研究概况15-16
- 1.3 论文的主要研究内容16-18
- 第二章 材料与方法18-35
- 2.1 实验动物来源18
- 2.2 主要设备及器材18-19
- 2.3 主要试剂及配制19-22
- 2.4 实验流程与方法22-34
- 2.4.1 原代小鼠肾小球系膜细胞（MCs）的培养22-23
- 2.4.2 系膜细胞培养及主要技术23-25
- 2.4.3 细胞给药与分组25-26
- 2.4.4 总RNA提取，，逆转录及PCR26-29
- 2.4.5 Western blot法29-32
- 2.4.6 MTT法检测细胞增殖32-33
- 2.4.7 流式细胞仪测定细胞凋亡33
- 2.4.8 5/6 肾切除慢性肾衰竭模型的建立33-34
- 2.4.9 血、尿的收集检测34
- 2.4.10 免疫组化34
- 2.5 统计学分析34-35
- 第三章 结果35-54
- 3.1 EP1受体参与TGF-β1 诱导的系膜细胞增殖、内质网应激及肾脏纤维化的机制研究35-45
- 3.1.1 EP1基因敲除小鼠鉴定35
- 3.1.2 TGF-β1 诱导的EP1-/- 系膜细胞FN、CTGF mRNA和蛋白的表达35-37
- 3.1.3 TGF-β1 诱导的EP1-/- 系膜细胞GRP78、TRPC1蛋白的表达37
- 3.1.4 TGF-β1 诱导的EP1-/- 系膜细胞ERK1/2 蛋白的表达37-38
- 3.1.5 EP1激动剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞GRP78、TRPC1蛋白表达的影响38
- 3.1.6 EP1激动剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞ERK1/2 蛋白表达的影响38-39
- 3.1.7 EP1拮抗剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞GRP78、TRPC1蛋白表达的影响39-40
- 3.1.8 EP1拮抗剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞ERK1/2 蛋白表达的影响40
- 3.1.9 TGF-β1 诱导的EP1-/- 系膜细胞凋亡率的表达40-41
- 3.1.10 EP1-/- 各组小鼠生化指标改变41-42
- 3.1.11 EP1-/- 的 5/6 肾切除模型小鼠病理变化42-43
- 3.1.12 EP1-/- 的 5/6 肾切除模型小鼠免疫组化变化43-45
- 3.2 EP3 受体参与 TGF-β1 诱导的系膜细胞增殖、内质网应激及肾脏纤维化的机制研究45-54
- 3.2.1 EP3基因敲除小鼠鉴定45
- 3.2.2 TGF-β1 诱导的EP3-/-系膜细胞增殖的表达45-46
- 3.2.3 TGF-β1 诱导的EP3-/-系膜细胞GRP78、TRPC1蛋白的表达46
- 3.2.4 TGF-β1 诱导的EP3-/-系膜细胞ERK1/2 蛋白的表达46-47
- 3.2.5 EP3激动剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞GRP78、TRPC1蛋白表达的影响47
- 3.2.6 EP3拮抗剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞GRP78、TRPC1蛋白表达的影响47-48
- 3.2.7 EP3拮抗剂组对TGF-β1 诱导的系膜细胞ERK1/2 蛋白表达的影响48-49
- 3.2.8 TGF-β1 诱导的EP3-/-系膜细胞凋亡率的表达49-50
- 3.2.9 EP3-/- 各组小鼠生化指标改变50-51
- 3.2.10 EP3-/- 的 5/6 肾切除模型小鼠病理变化51-52
- 3.2.11 EP3-/- 的 5/6 肾切除模型小鼠肾脏免疫组化变化52-54
- 第四章 讨论54-58
- 第五章 结论58-59
- 参考文献59-62
- 英文缩写词表62-64
- 综述64-72
- 综述参考文献69-72
- 在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目72-73
- 致谢73
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